Page 36 - 《中国药房》2021年10期
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阿尔茨海默病（AD）是一种以认知障碍为主要表现                         ZH-200KBS 型高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械
        的中枢神经系统退行性病变 。β-淀粉样蛋白（Aβ）在脑                         厂）等。
                                 [1]
        内过度累积形成的淀粉样蛋白斑块是AD的典型病理特                            1.2 主要药品与试剂
        征 。Aβ主要包括Aβ 1-40和Aβ 1-42两种亚型，其中Aβ 1-42在                 芥子酸对照品（批号S30697，纯度≥97％）购自上海
          [2]
        AD患者脑内最具神经元毒性，易引起老年斑的形成                    [2－3] 。  源叶生物科技有限公司；Aβ 1-42蛋白（批号bs-0107p）购自
            目前，美国 FDA 批准用于治疗 AD 的药物有两类，                     北京博奥森生物技术有限公司；RPMI 1640 培养基（改
        一类是胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐、加兰他敏等；另一                           良型，货号SH30809.01）购自美国HyClone公司；胎牛血
        类是 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗药，如盐酸                       清（批号 04-007-1A）购自美国 BI 公司；大鼠 BDNF 酶联
        美金刚；但这两类药物均不能有效逆转 AD 的进程 。                          免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号 E30664）购自北京
                                                      [4]
        2019年11月，国家药品监督管理局批准了治疗AD的新                         诚林生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液、苯甲基磺酰
        药——九期一 （甘露特钠胶囊，GV-971）的上市申请，该                       氟（PMSF）蛋白酶抑制剂（100×）、BCA蛋白浓度试剂盒、
                    ®
        药的主要成分是海洋褐藻中的低分子酸性寡糖类化合                             特超敏 ECL 化学发光试剂盒（批号分别为 P0013B、
        物，能够通过调节肠道菌群的靶向脑-肠轴而改善患者                            P1005、P0010S、P0018AS）均购自上海碧云天生物技术
        的认知功能，从而治疗轻中度 AD 。由此可见，从天然                          有 限 公 司 ；磷 酸 酶 抑 制 剂 混 合 物（100 ×）（批 号
                                     [5]
        药物中寻找用于防治AD的有效成分是可行的。                               CW2383S）购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司；
            芥子酸，又称 3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸，广泛分                     十二烷基硫酸钠（SDS）、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺
        布于水果、蔬菜、谷物中，其衍生物有芥子碱、丁香醛                           （TEMED）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国 Sigma 公司；
        等。研究指出，芥子酸对 AD、共济失调、帕金森病等神                          预染蛋白质Maker（批号26616）购自加拿大Fermentas公
                                      [6]
        经退行性疾病有一定的治疗作用 。相关药理实验发                             司；胰蛋白酶、青链霉素混合液（100×）、噻唑蓝（MTT）、
        现，芥子酸作为一种神经保护剂，能够减轻Aβ 1-42诱导的                       脱脂奶粉（批号分别为TB150、P1400、M8180、D8340）均
        小鼠海马CA1区神经细胞损伤，并能够改善红藻氨酸引                           购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠β-肌动蛋白（β-ac-
        起的小鼠认知障碍，提示该化合物可能对 Aβ 1-42诱导的                       tin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗
        神经元毒性具有拮抗作用，但其作用机制不详                     [7－8] 。另   兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记的山羊抗小鼠IgG
        有研究报道，脑源性神经营养因子（BDNF）与酪氨酸激                          二抗（批号分别为 151218、122826、122011）均购自北京
        酶B（TrkB）受体结合后，可使TrK受体二聚化，从而激活                       中杉金桥生物技术有限公司；兔ERK1/2、TrkB多克隆抗
        细 胞 外 信 号 调 节 激 酶（ERK）/核 糖 体 S6 蛋 白 激 酶             体（批号分别为11257-1-AP、13129-1-AP）均购自武汉三
        （RSK）、磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）等                 鹰生物技术有限公司；兔磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/2）多
        下游信号转导通路，诱导信号级联反应；BDNF将上游信                          克隆抗体（批号#4377）购自美国CST公司；总RNA提取
        号转移至细胞核内，使部分核内的转录因子发生磷酸                             试剂（RNAiso Plus）、PrimeScrip TM  RT reagent Kit（Perfect
                                                                                               TM
        化，对神经元存活、突触功能和突触可塑性具有重要作                            real time）试剂盒、SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH
                                                                                 ®
        用 [9－10] 。基于此，本研究在前期研究的基础上，以BDNF/                   plus）试剂盒（批号分别为 D9108A、RR037A、RR420A）
                                                            均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海生
        TrkB/ERK 信号通路为研究切入点，探讨芥子酸对 Aβ 1-42
        致PC12细胞损伤的保护作用机制，为开发防治AD的创                          物工程股份有限公司设计、合成；所用试剂均为分析纯，
        新候选药物提供科学的实验依据。                                     水为超纯水。
        1 材料                                                1.3 细胞

        1.1 主要仪器                                                大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）购自
            本研究所用主要仪器包括 DL-CJ-2NDII Ⅱ型超净                    中国科学院上海细胞生物研究所。
        工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、Series 8000                     2 方法
        型 CO2培养箱和 QuantStudio 5 型实时荧光定量聚合酶                  2.1 Aβ1-42溶液的制备
        链式反应（PCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、               将 1 mg 的 Aβ 1-42溶解于 221.5 μL 的水中，制成浓度
        M200 PRO 型多功能酶标仪（瑞士 Tecan 公司）、CKX41-                为1 000 μmol/L的溶液，置于37 ℃、5％CO2培养箱中孵
        A32PH型倒置显微镜（日本Olympus公司）、AL204型电                    育24 h（培养条件下同），于－20 ℃保存，备用。
        子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）、5804R型离                        2.2 分组
        心机（德国Eppendorf公司）、C1000 Touch型基因扩增仪                     根据课题组前期MTT实验结果，Aβ 1-42诱导PC12细
        和 Gel Doc XR 型凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司）、                胞损伤的最适浓度为 2 μmol/L，芥子酸对 PC12 细胞损
        S11-6-S 型恒温水浴锅（上海跃进医疗器械厂）、LD-                       伤具有改善作用的浓度范围为 32～128 μmol/L。本研


        ·1182 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10                                 中国药房    2021年第32卷第10期
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