Page 42 - 《中国药房》2021年10期
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变应性鼻炎（AR）为耳鼻咽喉头颈外科最常见的疾                         1.3 动物
        病之一   [1－3] 。据统计，世界范围内约有10.0％～40.4％的                    SPF级C57/BL6小鼠30只，雌雄各半，6～8周龄，体
        人口具有AR的临床表现           [4－6] 。研究表明，内源性活性氧            质量（20±2）g，由南京中医药大学动物实验中心提供，
        簇（ROS）水平升高以及 Janus 激酶 2（JAK2）、信号转导                  动物使用许可证号为 SYXK（苏）2018-0049。所有动物
        及转录激活蛋白6（STAT6）信号分子活化是变应性炎症                         按每笼5只饲养于南京中医药大学动物实验中心，室温
        发生发展的重要病理机制，而选择性降低 ROS 水平，抑                         为22～24 ℃，相对湿度为50％～60％，光照时间为每天
        制 JAK2、STAT6 信号分子活化，则能显著改善 AR 等变                    12 h；自由摄食饮水，每3天更换1次垫料。本研究实验
        应性炎症     [7－10] 。黄芪甲苷是 AR 治疗经验方——益气温                方案获得南京中医药大学动物伦理委员会的批准。
        阳方中君药黄芪的重要成分             [11－13] 。研究显示，该成分能         2 方法
        有效改善变应性炎症，但其作用机制尚不明确                    [14－15] 。基  2.1 造模、分组与给药
        于此，本研究拟从 ROS 以及 JAK2/STAT6 信号通路角度                       将30只C57/BL6小鼠按随机数字表法分为空白组、
        出发，初步研究黄芪甲苷对 AR 模型小鼠改善作用的可                          模型组、黄芪甲苷组，每组10只。采用基础致敏联合攻
        能机制，旨在为AR的中医药治疗提供科学依据。                              击致敏以复制 AR 模型。于造模第 0、7、14 天进行基础
        1 材料                                                致敏：模型组和黄芪甲苷组小鼠于上述时间点分别单次
        1.1 主要仪器                                            腹腔注射 OVA-氢氧化铝混悬液（以 OVA 25 μg、氢氧化
            本研究所用主要仪器包括BX51型正置荧光显微镜                         铝 1 mg 加入至生理盐水 300 μL 中，制得）；空白组小鼠
        和 SZ51 型体视显微镜（日本 Olympus 公司）、ChemiDoc               于相同时间点单次腹腔注射同体积生理盐水。于造模
        XRS 型化学发光检测仪（美国 Bio-Rad 公司）、CM3050                  第21～27天连续进行攻击致敏：模型组和黄芪甲苷组小
        S型冰冻切片机（德国Leica公司）等。                                鼠双侧鼻腔滴入 OVA 混悬液（以 OVA 500 μg 加入至生
        1.2  主要药品与试剂                                        理盐水20 μL中，制得），每侧10 μL，每天1次；空白组小
                                                            鼠于相同时间点同法滴入等体积生理盐水。于造模第
            黄芪甲苷对照品（批号b10462，纯度≥98％）购自上
                                                            15～27天，黄芪甲苷组小鼠腹腔注射黄芪甲苷40 mg/kg
        海 士 锋 生 物 科 技 有 限 公 司 ；卵 清 蛋 白（OVA，批 号
                                                           （以生理盐水为溶剂，第 21～27 天于攻击致敏前 1 h 给
        O1641，纯度≥98％）购自美国 Sigma 公司；ROS 检测荧
                                                            药） [15－18] ，按 0.02 mL/g 给药，每天 1 次；空白组和模型组
        光探针-二氢乙啶（DHE）试剂盒（批号KGAF019）购自南
                                                            小鼠同法注射等体积生理盐水。若小鼠出现频繁挠鼻、
        京凯基生物科技发展有限公司；甲苯胺蓝染料（批号
                                                            喷嚏，则视为造模成功           [19 － 20] 。AR 建模及给药流程见
        D034-1-1）购自南京建成生物工程研究所；苏木精-伊红
                                                            图1。
        （HE）染色试剂盒、TritonX-100 试剂、十二烷基硫酸钠
                                                                                           黄芪甲苷 40 mg/kg
        （SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、ECL 化学发光试剂盒、                                                        腹腔注射
        BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山
                                                            时间，天 0         7         14                 27 28
        羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批号分别为 C0105S、
        ST795、ST626、ST025、P0018AS、P0012、A0208）均购自
                                                                OVA 25 μg+氢氧化铝1 mg+生理盐水300 μL  OVA 500 μg+生理盐水20 μL
        上海碧云天生物技术有限公司；冰冻切片包埋剂（批号                                         基础致敏                    攻击致敏
        4583）购自美国Sakura公司；含4′，6-二脒基-2-苯基吲哚                               图1 AR建模及给药流程
        （DAPI）的抗荧光淬灭封片液（批号 H-1200）购自美国                         Tab 1 AR modeling and administration process
        Vector Laboratories公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（批号              2.2  小鼠样本的收集与制备
        IPVH00010）购 自 美 国 Millipore 公 司 ；白 细 胞 介 素 4        2.2.1  鼻腔灌洗液      于末次OVA鼻腔攻击致敏24 h后，
        （IL-4）、IL-5、干扰素γ（IFN-γ）酶联免疫吸附测定（ELISA）              以戊巴比妥钠进行麻醉，并将小鼠固定于超净工作台内
        试剂盒（批号分别为 70-EK204HS-96、70-EK205HS-96、              甲板上，以75％乙醇消毒后剖开颈部，分离气管，于气管
        70-EK280HS-96）均购自杭州联科生物技术股份有限公                      内注入生理盐水 1 mL，收集小鼠鼻腔流出的液体，于
        司；兔磷酸化 JAK2（p-JAK2）单克隆抗体、兔 JAK2 单克                  4 ℃下以 1 000×g 离心 10 min，吸取上清液，分装保存
        隆抗体、兔磷酸化 STAT6（p-STAT6）多克隆抗体、兔                      于－80 ℃冰箱中，备用。
        STAT6 单克隆抗体、兔β-肌动蛋白（β-actin）兔多克隆抗                   2.2.2  不经固定的组织切片           收集鼻腔灌洗液后处死
        体（批号分别为 ab32101、ab108596、ab28829、ab32520、           小鼠，每组取3只小鼠，分离其新鲜鼻黏膜及脾脏组织，
        ab8227）均购自英国Abcam公司；CoraLite 594标记的驴                以冰冻切片包埋剂包埋后切片，制得厚约 7 μm 的新鲜
        抗兔 IgG 二抗（批号 SA00013-8）购自美国 Proteintech 公           冰冻组织切片，用于DHE染色；每组另取3只小鼠，分离
        司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为纯化                            其新鲜脾脏，经锡纸包裹后放入试剂管中，液氮速冻后，
        水或超纯水。                                              移至－80 ℃冰箱中，备用。


        ·1188 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10                                 中国药房    2021年第32卷第10期
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