Page 34 - 《中国药房》2021年第9期
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significantly increased（P＜0.01）；follicles were crumpled and lost nucleus，ovarian interstitial were fibrosis，luteum were loose；
        AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian tissue were mainly distributed in the follicle membrane and ovarian interstitial. Compared
        with model group，the serum level of AMH，the expression of AMHR Ⅱ and Smad4 protein in ovarian tissue was increased
        significantly in GDFG groups（P＜0.01），while the serum level of FSH was decreased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）；in
        ovarian tissue，follicles at all levels could be found and follicle morphology was improved，and no obvious nuclear loss and
        cumulus formation were found；AMHRⅡ and Smad4 protein were mainly distributed in the follicular nucleus（except for GDFG
        high-dose group) and the granular cell membrane（mainly distributed in the sinus follicles of GDFG medium-dose group）；they
        were slightly distributed around the mature follicular nucleus or in corpus luteum. CONCLUSIONS：GDFG can improve ovarian
        function of DOR model mice. The mechanism may be related with promoting serum level of AMH，protein expression of AMHRⅡ
        and Smad4，improving the distribution of AMHRⅡ and Smad4 protein in ovarian granulosa cell membrane and follicular nucleus，
        reducing FSH levels.
        KEYWORDS     Decreased ovarian reserve；Guiyuan decoction formula granules；Anti-Müllerian hormone；Follicle stimulating
        hormone；Anti-Müllerian hormone receptor；Smad4；Mice


            卵巢储备功能下降（DOR），是指卵巢内卵母细胞的                        相关基因的表达 。然而，GDFG 是否可通过 AMH/
                                                                            [17]
        数量减少和（或）质量下降，同时伴有抗米勒管激素                             Smad信号通路改善DOR的作用机制尚不明确，基于此，
        （AMH）水平降低、窦卵泡数减少、促卵泡生成素（FSH）                        本研究采用腹腔注射顺铂以复制 DOR 模型小鼠，通过
                                  [1]
        水平升高、患者生育能力下降 。DOR临床表现有月经                           不同剂量GDFG干预后，检测小鼠血清中AMH、FSH的
        后期（即月经周期延后7天及以上）、经量减少等，其进一                          水平，观察其卵巢组织形态和卵泡发育情况，并检测其
        步发展可出现月经频发或月经稀发、闭经，甚至卵巢早                            卵巢组织中 AMHRⅡ、Smad4 蛋白的分布和表达水平，
                        [2]
        衰、生育能力丧失 。DOR 的病因尚不明确，目前普遍                          以探讨GDFG改善卵巢储备功能的机制，以期为中医药
        认为其是由多因素所致，如基因损伤、染色体异常、自身                           防治DOR提供理论依据。
        免疫损伤、手术损伤、放化疗、感染等；另外，环境变化、                          1 材料
        生活习惯或嗜好不良，亦可促进DOR的发生发展                    [3－8] 。   1.1  主要仪器
            目前，西医临床对DOR并无特效治疗方法，一般以                             本研究所用主要仪器有：MK3型酶标仪（美国Ther-
        调节生活方式、干预心理状态、激素补充等治疗为主 。                           mo Fisher Scientific 公司）、Multizoom AZ100 型光学生
                                                      [9]
        DOR 属于中医妇科学“月经后期”“月经过少”等疾病范                         物显微镜[尼康仪器（上海）有限公司]、GH-200型万分之
        畴，中医治疗多以滋肾填精、调理冲任、濡养胞宫等为                            一电子天平（日本 A＆D 公司）、Centrifuge5804R 型高速
        主 [10－11] 。癸源煎处方是由明代医学大家张介宾的《景岳                     冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、RM2125RTS型石蜡
              [12]
        全书》 中“地黄醴”一方加味而成，由熟地黄、枸杞子、                          切片机（瑞士Lecia公司）、TissueRuptor Ⅱ型手持式匀浆
        肉苁蓉、仙灵脾、菟丝子、鸡血藤、香附等7味药物组成，                          器（德国Qiagen公司）、Tanno 5200型化学发光凝胶成像
        现已被上海中医药大学附属龙华医院院开发成院内制                             仪（上海天能科技有限公司）。
        剂“癸源煎配方颗粒”（以下简写为“GDFG”）。经本课题                        1.2  主要药品与试剂
        组前期临床研究发现，该配方颗粒对于 DOR 患者有较                              本研究所用主要药品与试剂有：注射用顺铂（齐鲁
        好的改善症状，可保护患者的卵巢功能 。目前，本课                            制药有限公司，批号 FA4A8106A，规格 10 mg），GDFG
                                           [13]
        题组也正在进行GDFG的多中心、大样本的临床随机双                          （四川新绿色药业科技发展有限公司），戊酸雌二醇（拜
        盲试验，以期为其上市奠定基础。                                     耳医药保健有限公司广州分公司，批号J20171038，规格
            相关研究发现，卵巢颗粒细胞异常增殖或凋亡、卵                          1 mg），血清AMH、FSH酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂
        泡发育不良、优势卵泡形成减少，可导致 DOR                  [14－15] 。其  盒（上 海 欲 鹏 生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为
        中，卵泡的发育主要经历募集、选择、成熟等生物过程，                           LA374189、LF374103），兔源AMHRⅡ单克隆抗体、兔源
        其募集与选择过程受 AMH、FSH 调控：AMH 一方面可                       Smad4单克隆抗体、兔源GAPDH多克隆抗体、ECL化学
        防止 2～8 mm 的小窦卵泡过度增长，并降低窦卵泡对                         发光试剂（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为
        FSH 的敏感性，从而促进优势卵泡的选择，进而有效防                          PB1037、PB0446、A00227-1、AR1191），生物素高效标记
                                   [16]
        止卵泡池耗竭、调控卵泡生长 ；另一方面，AMH 可与                          的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）多克隆抗体（二抗）、磷
        AMH 受体Ⅱ（AMHRⅡ）结合，然后经过信号传导与公                         酸盐缓冲液（PBS）、山羊血清、RIPA 裂解液、BSA 溶液、
        共蛋白Smad4相结合，从而进入细胞核内调控卵巢功能                          BCA 蛋白浓度测定试剂盒、DAB 辣根过氧化物酶显色


        ·1052 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 9                                   中国药房    2021年第32卷第9期
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