Page 35 - 《中国药房》2021年第9期
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试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为                            2.4  小鼠卵巢组织中 AMHRⅡⅡ、Smad4 蛋白的分布情
        A0279、C0221A、C0265、P0013C、ST025、P0012S、            况检测
        P0202），TBST 缓 冲 液（ 美 国 Sigma 公 司 ，批 号                  采用免疫组化法进行检测。取“2.3”项下各小鼠另
        91414-10TAB），生理盐水（上海百特医疗用品有限公司，                    外 4 片切片，经脱蜡并复水后，以 PBS 冲洗 5 min×3 次，
        批号H19994067）；其余试剂为实验室常用规格，水为纯                      滴加 3％H2O2室温静置 10 min；以 PBS 冲洗 5 min×3 次，
        净水。                                                置于枸缘酸钠溶液中煮沸10 min以热修复抗原；冷却后
        1.3 动物                                             以PBS冲洗5 min×3次，滴加山羊血清进行封闭，室温静
            本研究所用动物为 SPF 级 ICR 小鼠，雌性，8 周龄，                 置 20 min；甩去多余液体，滴加 AMHRⅡ、Smad4 一抗
        体质量为25～30 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限                       （稀释度均为1 ∶ 500）50 µL，室温静置1 h；以PBS冲洗5
        责 任 公 司 ，实 验 动 物 生 产 许 可 证 号 为 SCXK（沪）             min×3次，滴加二抗（稀释度为1 ∶ 2 000）50 µL，室温静置
        2018-0006。小鼠饲养于上海市计划生育科学研究所清                       1 h；以 PBS 冲洗 5 min×3 次，经 DAB 显色 10 min 后，以
        洁级动物实验中心，环境温度为 24 ℃、湿度为 60％、昼                      PBS 冲洗 10 min 后脱水封片，并于光学显微镜下观察，
        夜光照节律为12 h。饲养期间饲料及饮用水充足，动物                         拍照。当切片中出现明显的棕黄色颗粒则为阳性表达，
        可自由饮食、进水。                                          出现不着色或浅色则为阴性表达。
        2 方法                                               2.5  小鼠卵巢组织中 AMHRⅡⅡ、Smad4 蛋白表达水平
        2.1 分组、造模与给药                                       的检测
            小鼠适应性喂养 5 天后，根据文献[18－19]方法对                        采用Western blot法进行检测。取“2.3”项下各组小
        小鼠进行阴道脱落细胞学检查，筛选出动情周期正常的                           鼠右侧卵巢组织，剪碎，按照每 20 mg 组织加入 200 μL
        小鼠共42只，然后随机分为对照组、模型组、戊酸雌二醇                         裂解液的比例加入RIPA裂解液，于匀浆机中研磨，直至
        组（阳性对照，0.15 mg/kg，剂量根据临床等效剂量换算                     裂解液中组织块消失。充分裂解后，以 12 000 r/min 离
        而得）和GDFG低、中、高剂量组（0.75、1.49、2.98 g/kg，剂             心5 min，取上清液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋
        量分别为临床等效剂量的0.5、1、2倍），每组7只。除对                       白浓度。蛋白经变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯
        照组外，其余各组小鼠均腹腔注射顺铂（3 mg/kg，以生理                      酰胺（SDS-PAGE）电泳分离，然后转膜 70 min，以 5％
        盐水溶解）复制 DOR 模型。造模期间各组小鼠每天上                         BSA 溶液室温封闭 2 h；以 TBST 洗膜 5 min×3 次，加入
        午9时进行阴道脱落细胞学检查：当其阴道上皮细胞、角                          AMHRⅡ、Smad4、GAPDH一抗（稀释度均为1 ∶ 500），孵
        化细胞明显减少，白细胞明显增多时，表明造模成功。                           育过夜；以 TBST 洗膜 5 min×3 次，加入二抗（稀释度为
        造模成功后，GDFG各剂量组和戊酸雌二醇组小鼠每日                          1 ∶ 2 000），孵育 1 h；以 TBST 洗膜 5 min×3 次，经 ECL 显
        上午 9 时灌胃相应药液 0.3 mL（临用时以生理盐水溶                      色后，置于凝胶成像仪中曝光成像。采用 Image J 1.8.0
        解），对照组和模型组小鼠灌胃等体积生理盐水，连续给                          软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以 AMHRⅡ、
        药4周。                                               Smad4与内参GAPDH的灰度值的比值表示相应蛋白表
        2.2  小鼠血清中AMH、FSH水平的检测                             达水平。
            采用ELISA法进行检测。末次给药后，各组小鼠通                       2.6  统计学方法
        过腹腔注射 2％戊巴比妥钠（80 mg/kg）麻醉后，于腹主                         采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。数据以
        动脉采血。血样于室温静置 2 h 后，以 3 000 r/min 离心                x±s表示。多组间比较，若数据符合正态分布且方差齐
        10 min，取上清液，按试剂盒说明书相关方法操作，采用                       性采用单因素方差分析；若方差不齐，以 Kruskal-Wallis
        酶标仪于450 nm波长下测定血清中AMH、FSH的水平。                      H检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
        2.3 小鼠卵巢组织的病理学形态观察                                 3 结果
            各组小鼠采血后，处死，取其左侧卵巢组织，置于                         3.1 小鼠血清中AMH、FSH水平的测定结果
        4％多聚甲醛溶液中固定，经70％、80％、90％、95％乙醇                         与对照组比较，模型组小鼠血清中 AMH 水平显著
        和无水乙醇梯度脱水，再以二甲苯透明替换、浸蜡、包                           降低，FSH 水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，戊
        埋、切片（厚度约 5 μm），平行制备 6 片。将石蜡切片以                     酸雌二醇组和GDFG各剂量组小鼠血清中AMH水平均
        二甲苯分次脱蜡，于无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇中逐                        显著升高（P＜0.01），FSH 水平均显著降低（P＜0.05 或
        级浸泡，然后以水冲洗。各小鼠取2片切片进行苏木精-                          P＜0.01），详见表1。
        伊红（HE）染色（另外4片后续进行免疫组化实验），然后                        3.2 小鼠卵巢组织病理学形态观察结果
        于光学显微镜下观察卵巢组织的病理学形态。                                   对照组小鼠卵巢组织中可见各级卵泡，窦卵泡、排


        中国药房    2021年第32卷第9期                                              China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 9  ·1053 ·
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