Page 79 - 《中国药房》2021年8期
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器搅拌过夜，使胶原充分溶解。次日，于 4 ℃下将上述                         2.6 大鼠胸腺指数和脾指数测定
        胶原溶液逐滴滴加至等体积的弗氏完全佐剂中（边滴加                               取大鼠胸腺和脾脏，根据如下公式计算其胸腺指数
        边搅拌，直到乳化至油包水状态，且以在水中不扩散为                           和脾指数：胸腺指数＝胸腺质量（mg）/大鼠体质量（g）；
        宜），将此作为初次免疫乳化剂；由弗氏不完全佐剂替换                          脾指数＝脾质量（mg）/大鼠体质量（g）。
        弗氏完全佐剂制备继发免疫乳化剂，制备步骤同前。在                           2.7 大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平测定
        48只大鼠中随机选8只作为正常对照组（雌雄各半）；剩                             取大鼠血清适量，采用ELISA法以酶标仪测定各组
        余 40 只大鼠先在尾根部皮下单次注射初次免疫乳化剂                         大鼠血清中 IL-1β、TNF-α、IL-6 水平。实验严格按照相
                                                           应试剂盒说明书操作。
        100 μL，初次免疫7天后，再于每只大鼠尾根部皮下单次
                                                           2.8  大鼠滑膜组织中 NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB、
                                                 [11]
        注射继发免疫乳化剂 100 μL，以建立 CIA 模型 ；正常
                                                           p-IκB蛋白表达水平测定
        对照组大鼠同步注射无菌生理盐水。利用大鼠关节炎
                                                               采用 Western blot 法进行测定。取各组大鼠膝关节
        指数评分（标准详见“2.3”项下）评价造模情况：4个关节
                                                           滑膜组织，匀浆后，采用总蛋白提取试剂盒提取组织中
                                                    [12]
        评分相加，累积评分≥4分则表示CIA模型制备成功 。
                                                           的总蛋白，采用 BCA 蛋白定量试剂盒说明书方法测定
            将造模成功的40只大鼠随机分为模型组，党参提取
                                                           蛋白浓度。将蛋白变性常规加热变性后，取 20 μg 于
        物低、中、高剂量组（0.44、0.88、1.76 g/kg，以生药量计）和
                                                           100 V 电压下进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
        地塞米松组（阳性对照，0.002 5 g/kg），每组8只（雌雄各
                                                           泳 60 min，然后在 300 mA 恒流下转移至聚偏二氟乙烯
        半）。地塞米松组大鼠给药剂量根据成人（体质量 70                          膜 2 h，用 5％脱脂牛奶在室温下封闭 2 h；加入 NF-κB
        kg）临床用量按人与大鼠体质量系数换算后得到；藏党                          p65、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB、GAPDH一抗（稀释比例均
        参提取物低、中、高剂量分别根据成人（70 kg）藏党参临                       为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以 TBST 溶液洗涤 5 min×3
        床用量（10 g）按人与大鼠体质量系数换算后得到，分别                        次，加入二抗（稀释比例均为1∶1 000），室温孵育1 h。以
        为成人临床给药量的1、2、4倍。各给药组大鼠均灌胃相                         TBST溶液洗涤5 min×3次，用ECL化学发光液显色后，
        应药物，灌胃体积 400 μL，每天 1 次，连续 28 天；正常对                 置于凝胶成像仪上成像。用 Image J v1.8.0 软件分析条
        照组和模型组大鼠同步灌胃等体积生理盐水。                               带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰度
        2.3  大鼠体质量和关节炎指数评分测定                               值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
            分别于给药前（记为 0 天）和给药 7、14、21、28 天后                2.9  统计学方法
        称定各组大鼠体质量，并对其左后足关节进行关节炎指                               利用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。数据以
        数评分。评分标准如下：0分为关节无肿胀；1分为关节                          x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
        轻微肿胀；2分为关节中度肿胀；3分为关节严重肿胀；4                         比较采用 LSD-t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学
                                  [11]
        分为关节严重肿胀并影响运动 。本指标评判由3人完                           意义。
                                                           3 结果
        成，并取平均值作为最终评分结果。
        2.4  样本采集及处理                                       3.1  藏党参提取物对CIA模型大鼠体质量的影响
                                                               给药前（0 天），各组大鼠的体质量差异均无统计学
            末次给药1 h后，将各组大鼠麻醉，于腹主动脉采血，
                                                           意义（P＞0.05）。与正常对照组比较，模型组大鼠在给
        然后以3 000 r/min离心5 min，吸取上层血清，置于－20 ℃
                                                           药14、21、28天后的体质量均显著降低（P＜0.05）。与模
        冰箱中保存，备用。取血后，沿大鼠膝关节正中切开皮
                                                           型组比较，藏党参提取物中、高剂量组和地塞米松组大
        肤，暴露膝关节中心，提起髌骨，剥离完整的膝关节滑膜
                                                           鼠在给药21、28天后的体质量均显著升高（P＜0.05），但
        组织。将一部分滑膜组织置于脱钙液中进行脱钙处理，
                                                           藏党参提取物低剂量组大鼠在给药不同时间后的体质
        用于 HE 染色；另一部分置于－80 ℃冰箱中保存，用于
                                                           量差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠给药前和
        蛋白检测。完整摘取大鼠胸腺和脾脏，以生理盐水漂
                                                           给药不同时间后的体质量测定结果见表1。
        洗，用滤纸吸干多余水分后，称定质量，用于计算胸腺指
                                                           3.2  藏党参提取物对CIA模型大鼠关节炎指数评分的
        数和脾指数。                                             影响
        2.5 大鼠滑膜组织病理变化观察                                       与正常对照组比较，模型组大鼠的关节炎指数评分
            将经脱钙处理后的大鼠膝关节滑膜组织置于4％多                         在给药前（0 天）和给药不同时间后均显著升高（P＜
        聚甲醛溶液中固定24 h，随后分别用不同体积分数乙醇                         0.05）；与模型组比较，藏党参提取物中、高剂量组和地塞
        梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并进行常规石蜡切片                           米松组大鼠在给药 14、21、28 天后的关节炎指数评分均
       （厚度约为4 μm），行常规HE染色，并置于显微镜下观察                        显著降低（P＜0.05），但藏党参提取物低剂量组大鼠在
        各组大鼠滑膜组织病理变化情况。                                    给药前和给药不同时间后的关节炎指数评分差异均无


        中国药房    2021年第32卷第8期                                              China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 8  ·969 ·
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