Page 52 - 《中国药房》2021年07期
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境中，昼夜每12 h交替，自由摄食饮水。                                醉，迅速取出脑组织，以体积比1∶9添加生理盐水制备脑
        2 方法                                                组织匀浆液，以 10 000 r/m 离心 15 min，分离上清液，参
        2.1 分组、造模及给药                                        照 ELISA 试剂盒说明书，检测脑组织中 Ach、ChAT、
            大鼠适应性喂养7天后，随机分为空白对照组（生理                         AchE的含量。以上实验重复5次。
        盐水）、模型组（生理盐水）和 ICA 低、中、高剂量组（15、                     2.5  大鼠脑组织中 BDNF、ERK、CREB mRNA 表达水
        30、60 mg/kg，给药剂量参考文献[10]设置），每组 10 只。                平检测
        除 空 白 对 照 组 外 ，模 型 组 和 给 药 组 大 鼠 腹 腔 注 射                各组取 2 只大鼠，腹腔注射 10％水合氯醛进行麻
        MK-801（0.2 mg/kg，剂量参考文献[11]设置，溶剂为生理                 醉，迅速取出脑组织，加入Trizol试剂提取总RNA，再逆
        盐水）复制精神分裂症模型大鼠，每天 1 次，连续 14 天；                      转录合成 cDNA，然后以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。
        第15天进行Morris水迷宫实验，若造模大鼠的平均逃避                        BDNF 上游引物序列为 5′-TGCTTCAGCCGCTACCC-
        潜伏期与空白对照组大鼠的差值占该大鼠平均逃避潜                             3′，下游引物序列为 5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-
                                        [12]
        伏期的比值大于20％，表明造模成功 。造模过程中大                           3′，扩增长度为 527 bp；ERK 上游引物序列为 5′-TCAA-
        鼠无死亡。造模成功后，空白对照组和模型组大鼠灌胃                            GCCTTCCAACCTCCT-3′，下游引物序列为 5′-TGTTC-
        等体积水，给药组大鼠灌胃相应药物（以水为溶剂），每                           CACGGCACCTTATTT-3′，扩增长度为 1 082 bp；CREB
        天1次，连续28天，然后进行后续观察和检测。                              上游引物序列为 5′-CAGATTGCCACATTAGCCC-3′，下
        2.2 大鼠行为学观察                                         游引物序列为 5′-TTCCCTGTTCTTCATTAGACG-3′，扩
        2.2.1 Morris 水迷宫实验       参考文献[13]方法，将无光             增长度为 1 767 bp；GADPH 上游引物序列为 5′-GAT-
        线直射进入的水池分为4个象限，在目标象限中放置圆                            GCTGGTGCTGAGTATGCG-3′，下游引物序列为5′-GT-
        形平台。实验前5天，每天将各组大鼠置于目标象限的                            GGTGCAGGATGCATTGCTCTGA-3′，扩增长度为 200
        圆形平台上适应30 s，再将大鼠随机从任一向象限内放                          bp。PCR 反应体系（20 μL）为：cDNA 模板 1 μL，SYBR
        入，记录大鼠登上圆形平台的时间，即为逃避潜伏期；5                           FAST qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 1 μL，
        天后，撤去目标象限的圆形平台，将大鼠放入水池内，测                           ddH2O 7 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃
        试大鼠在目标象限内的穿越平台的次数（即穿台次数），                           变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。采
        以评价大鼠学习记忆能力。                                        用2  －ΔΔCt 法，以GADPH为内参，计算BDNF、ERK、CREB
        2.2.2  旷场实验      参考文献[14]方法，将各组大鼠放入                 mRNA的表达水平。以上实验重复5次。
        观察箱内，通过 Smart 系统记录 30 min 内大鼠自由活动                   2.6  大鼠脑组织中BDNF/ERK/CREB通路相关蛋白和
        的运动轨迹、路程，以前 10 min（T1 时段）活动路程长度                     凋亡相关蛋白表达水平检测
        表示大鼠探究行为，以 11～20 min（T2 时段）、21～30                       各组取 3 只大鼠，腹腔注射 10％水合氯醛进行麻
        min（T3时段）活动路程长度表示大鼠自主活动行为，评                         醉，迅速取出脑组织，加入蛋白裂解液提取蛋白；以
        价大鼠探究行为和自主活动行为。                                     12 000 r/min离心10 min，分离上层蛋白液，采用BCA法
        2.2.3  强迫游泳实验        参考文献[15]方法，将各组大鼠               检测蛋白浓度。蛋白经变性后进行SDS-PAGE电泳，转
        放入温水中强行游泳5 min，记录大鼠累积不动时间（可                         膜，以5％脱脂奶粉溶液中封闭1.5 h；TBST缓冲液清洗
        漂浮在水中且不挣扎），以评价大鼠绝望行为。                               5 min×3 次后，加入 BDNF、ERK1/2、p-ERK1/2、CREB、
        2.2.4 Y 迷宫实验       参考文献[16]方法，随机标记 Y 迷              p-CREB、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GADPH 一抗（稀释度均
        宫的 3 个臂支，先将大鼠放入迷宫中自由探索 2 min，再                      为1 ∶ 1 000），孵育过夜；TBST缓冲液清洗5 min×3次后，
        记录8 min内大鼠进入各个臂支的情况，计算交替率[交                         加入二抗（稀释度为1 ∶ 5 000）孵育1 h；加入ECL发光剂
        替率＝交替总次数/（入臂总次数－2）×100％，其中大鼠                        显色，经全自动凝胶成像系统成像。采用 Image J 1.8.0
        连续进入3个不同的臂支则为交替]，以评价大鼠空间识                           软件进行分析，以p-ERK1/2与ERK1/2、p-CREB与CREB
        别能力。                                                灰度值比值分别表示ERK1/2、CREB 的磷酸化水平，以
        2.3 大鼠海马组织病理形态学观察                                   Bcl-2与Bax的灰度值比值表示凋亡水平，以Caspase-3、
            在行为学观察实验结束后，各组取2只大鼠，腹腔注                         BDNF 蛋白与内参 GADPH 的灰度值比值表示其表达
        射 10％水合氯醛进行麻醉，迅速取出脑组织，在冠状位                          水平。
        切取海马组织，制备石蜡切片，进行常规Nissl染色，于显                        2.7 统计学方法
        微镜下观察海马组织的神经元形态，随机挑选5个视野，                               采用 SPSS 18.0 软件进行数据分析与处理，计量资
        计数Nissl染色阳性神经元。                                     料以 x±s 表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两
        2.4  大鼠脑组织中胆碱能相关指标的检测                               两比较采用 LSD-t 检验，以 P＜0.05 表示差异有统计学
            各组取 3 只大鼠，腹腔注射 10％水合氯醛进行麻                       意义。


        ·814 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 7                                    中国药房    2021年第32卷第7期
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