Page 70 - 《中国药房》2021年第6期
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盐缓冲液（PBS，pH＝7.2～7.4）清洗细胞1次后，按“2.3” 3 结果
项下方法分组（无需设置空白孔，下同）、给药（仅此试验 3.1 湿润烧伤膏对脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞
使用含 0.1％胎牛血清的 DMEM 培养基进行培养）。分 存活率的影响
别于培养0、24、48 h时拍照记录细胞迁移情况并计算细 与对照组比较，脂多糖组细胞存活率显著升高（P＜
胞迁移率：细胞迁移率（％）＝（0 h划痕宽度－某时间点 0.01）。与脂多糖组比较，康复新液组和湿润烧伤膏组细
划痕宽度）/0 h划痕宽度×100％。试验重复3次。 胞存活率均显著降低（P＜0.01）；而康复新液组与湿润
2.5 细胞上清液中TNF-α和IL-6含量检测 烧伤膏组比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见图1。
采用 ELSIA 法进行检测。取对数生长期细胞接种
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于6孔板中，接种密度为2×10 个/孔，按“2.3”项下方法分
组、给药。培养48 h后，取细胞上清液，以3 000 r/min离 100
心 10 min，取上清液，按照 ELISA 试剂盒说明书进行操 ％ 75
作，使用酶标仪测定细胞上清液中 TNF-α和 IL-6 含量。 细胞存活率， 50
试验重复3次。
2.6 细胞内IL-6蛋白定位和荧光强度检测 25
采用免疫荧光法进行检测。取对数生长期细胞接 0
种于共聚焦培养皿中，接种密度为 5×10 个/皿，按“2.3” 对照组 脂多糖组 康复新液组 湿润烧伤膏组
3
组别
项下方法分组、给药。培养 48 h 后，弃上清液，细胞用
＊＊
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注：与对照组比较， P＜0.01；与脂多糖组比较，P＜0.01
PBS 清洗 5 min×3 次，用 0.4％多聚甲醛溶液固定 30
Note：vs. control group， P＜0.01；vs. LPS group， P＜0.01
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min；细胞用 PBS 清洗 5 min×3 次，用 0.1％Triton X-100 图1 湿润烧伤膏对脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞
试剂透化20 min；细胞用PBS清洗5 min×3次，用封闭液 存活率的影响（x±±s，n＝3）
室温封闭 10 min，加入 IL-6、β-tubulin 一抗（稀释度均为
Fig 1 Effects of MEBO on survival rate of LPS-
1 ∶ 200），于 4 ℃下孵育过夜；细胞用 PBS 清洗 5 min×3
induced skin fibroblasts of rats（x±±s，n＝3）
次，加入相应的 IgG（H+L）标记二抗（稀释度均为 1 ∶
3.2 湿润烧伤膏对脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞
200），室温避光孵育40 min；细胞用PBS清洗5 min×3次
（此步骤及后续步骤均需避光操作），用5 μg/mL的DAPI 迁移的影响
染料染色 10 min，用 PBS 溶液清洗，滴加抗荧光衰减封 与对照组比较，脂多糖组细胞在作用 24、48 h 时的
片剂后封片，使用激光扫描共聚焦显微镜成像，观察 细胞迁移率均降低，其中48 h时细胞迁移率组间比较差
IL-6蛋白定位并记录荧光强度。 异有统计学意义（P＜0.01）。与脂多糖组比较，康复新
2.7 细胞中PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6、PI3K、Akt蛋白 液组和湿润烧伤膏组作用 24、48 h 的细胞迁移率均增
表达检测 加，其中48 h时细胞迁移率组间比较差异有统计学意义
采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期细胞 （P＜0.01）；而康复新液组与湿润烧伤膏组比较差异无统
接种于培养皿中，接种密度为 8×10 个/皿，按“2.3”项下 计学意义（P＞0.05），详见图2、图3（湿润烧伤膏作用24 h
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方法分组、给药。培养48 h后，弃上清液，细胞用4 ℃预 对脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞迁移的影响图略）。
冷PBS清洗2次，以RIPA裂解，于4 ℃下12 000 r/min离 3.3 湿润烧伤膏对脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞
心 10 min，取上清液，即得细胞总蛋白。取上述总蛋白 上清液中TNF-α、IL-6含量的影响
40 μg，煮沸 5 min 进行变性；取变性蛋白经十二烷基硫 与对照组比较，脂多糖组细胞上清液中TNF-α、IL-6
酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转膜，室温封闭 10 含量均显著升高（P＜0.01）。与脂多糖组比较，康复新
min，分 别 加 入 PTEN、p-p65、TNF-α、IL-6、PI3K、Akt、 液组和湿润烧伤膏组细胞上清液中 TNF-α、IL-6 含量均
GAPDH 一抗（稀释度均为 1 ∶ 2 000），于 4 ℃孵育过夜； 显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；而康复新液组与湿润烧
PBST 溶液洗膜 5 min×3 次，加入相应 IRDye 二抗（稀释 伤膏组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表1。
度均为1 ∶ 10 000），室温孵育40 min（此步骤及后续步骤 3.4 湿润烧伤膏对脂多糖诱导的大鼠皮肤成纤维细胞
均需避光操作），PBST溶液洗膜5 min×3次，于双色红外 内IL-6蛋白定位和荧光强度的影响
激光成像系统上成像。采用Image J 1.8.0软件处理并分 IL-6 主要在细胞质内表达。脂多糖组细胞内 IL-6
析，计算目标蛋白与内参（GAPDH）的灰度值比值，再以 蛋白表达荧光强度高于对照组。康复新液组和湿润烧
对照组为标准计算相对表达量。试验重复3次。 伤膏组细胞内IL-6蛋白表达荧光强度低于脂多糖组，且
2.8 统计学方法 康复新液组和湿润烧伤膏组的荧光强度接近，详见图
利用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。数据以 4[图中，“IL-6”标记 IL-6 阳性表达细胞（绿色），“β-tubu-
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两 lin”标记细胞微管（红色），“DAPI”标记细胞核（蓝色），
比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。 “Merge”为三者叠加]。
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