Page 37 - 《中国药房》2021年第6期
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(批号20190123)购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司; 流感病毒鸡胚尿囊液(血凝滴1∶640)以建立肾阳虚外感
苯甲酸雌二醇(批号151102)购自宁波第二激素厂;磷酸 复合模型,并以其出现精神萎靡、畏寒肢冷、形体消瘦、
奥司他韦胶囊(批号J20140121,规格75 mg)购自上海罗 体质量和肛温明显降低以及呼吸短促、打喷嚏等症状为
氏制药有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂 造模成功的外在表现。将造模成功的小鼠按体质量和
盒(批号 120219200908)购自上海碧云天生物技术有限 肾阳虚外感程度均分为3组,即模型组、阳性药组和麻黄
公司;动物组织总 RNA 提取试剂盒(批号 R6927)、 细辛附子汤组,每组12只。
FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒(批号 S7806)、Su- 2.3 给药
perReal 荧光定量预混试剂-增强版试剂盒(批号 S7918) 肾阳虚外感复合模型建立 24 h 后,进行给药干预。
均购自天根生化科技有限公司;小鼠 Cyt-C 酶联免疫吸 阳性药组小鼠给予磷酸奥司他韦胶囊 0.195 g/kg(人临
附测定(ELISA)检测试剂盒(批号20191130)、Cyt-CO活 床等效剂量,以水为溶剂溶解),麻黄细辛附子汤组小鼠
性测定试剂盒(批号 20191202)均购自南京建成生物工 给予麻黄细辛附子汤1.802 g/kg(以生药总量计,人临床
程研究所;PCR扩增引物由北京六合华大基因科技有限 等效剂量),正常组和模型组小鼠给予等体积生理盐
公司设计、合成;其余试剂均为分析纯或实验室常用规 水。各组小鼠均灌胃相应药液或生理盐水,灌胃体积均
格,水为超纯水。 为20 mL/kg,每天1次,连续6天。
1.3 动物 2.4 小鼠一般情况观察
健康 SPF 级雄性 Balb/c 小鼠共 48 只,体质量为 造模期间,每天观察小鼠的精神状况、活动状态,并
[19]
(18±2)g,由山东朋悦实验动物繁育有限公司提供,生 测定其自主活动次数和 5%负重游泳时间 。给药期
产许可证号为 SCXK(鲁)2014-0007。动物饲养环境温 间,每日测量小鼠体质量、肛温,记录其一般体征变化。
度为(22±2)℃、相对湿度为 40%~60%,饲以普通饲 将给药前小鼠的体质量定义为初始体质量,计算初始体
料和无菌水。本研究中的动物实验方案均符合山东中 质量百分率:初始体质量百分率(%)=体质量(g)/初始
医药大学动物伦理委员会标准。 体质量(g)×100%。
1.4 病毒 2.5 小鼠脏器指数测定
甲型 H1N1 流感病毒鼠肺适应株 FM1 由中国疾病 末次给药 24 h 后,脱颈椎处死小鼠,取其脾、胸腺、
预防控制中心病毒病预防控制所提供。 肺组织,称定质量,计算各脏器指数:脏器指数=脏器质
2 方法 量(mg)/体质量(10 g)。
2.1 麻黄细辛附子汤的制备 2.6 小鼠肺组织病理学观察
参照本课题组前期建立的提取方法制备麻黄细辛 取小鼠肺组织适量于 4%多聚甲醛溶液中固定 24
附子汤 [17-18] 。称取细辛30 g(最粗粉),加水240 mL浸泡 h,常规石蜡包埋、切片(约4 μm),进行常规苏木精-伊红
30 min后,进行回流提取,提取液经八层纱布滤过,收集 (HE)染色,然后在光学显微镜下观察小鼠肺组织病理
滤液,记为细辛单煎液;同时收集蒸馏馏分,将馏分上样 学变化。
到AB-8大孔树脂柱上进行富集纯化,以50%乙醇洗脱, 2.7 小鼠肺组织中病毒载量和心脏组织中 TLR3、
洗脱液经浓缩后,加入等体积乙醚萃取,收集萃取部位, TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表达水平测定
然后用β-环糊精包合(每 1 mL 挥发油用β-环糊精 6 g 包 采用实时荧光定量 PCR 法进行测定。取小鼠肺组
合)得到细辛挥发油环糊精包合物0.72 g。取麻黄30 g、 织和心脏组织各15~20 mg,分别按动物组织总RNA提
附子 60 g,加水 360 mL 浸泡 30 min,然后与细辛单煎液 取试剂盒说明书方法进行总RNA提取。采用紫外-可见
合并,煎煮 3 次,3 次煎煮的加水量分别为 360、300、300 分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度后,取光密度比值
mL,煎煮时间分别为 60、30、30 min,分别以八层纱布滤 (OD260 nm/OD280 nm )在1.8~2.1之间的样品,根据FastQuant
过,收集滤液。合并3次滤液,减压浓缩至340 mL,冻干 cDNA 第一链合成试剂盒说明书进行操作,在基因扩增
成粉末13.77 g。将冻干粉末13.77 g与细辛挥发油环糊 仪中(42 ℃孵育15 min;95 ℃孵育3 min;4 ℃冷却)逆转
精包合物0.72 g溶于水24 mL中,即得麻黄细辛附子汤, 录得到cDNA。以cDNA为模板采用两步法进行PCR扩
4 ℃保存,备用。 增。反应体系(共 20 μL)包括 2×SuperReal PreMix Plus
2.2 分组与造模 (含SYBR Green I)10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物
将小鼠随机分为正常组(12 只)和造模组(36 只)。 各 0.6 μL,RNase-free ddH2O 6.8 μL。反应条件为 95 ℃
造模组小鼠先腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液(8 mg/kg)7 预变性 15 min;95 ℃变性 10 s,60 ℃延伸 32 s,共 40 个
[19]
天(每天 1 次)以复制肾阳虚模型 。于造模第 7 天时, 循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参,采用
从造模的36只小鼠中随机选择12只检测其自主活动次 2 -ΔΔCt 法计算各组小鼠肺组织中甲型 H1N1 流感病毒 M
数和 5%负重游泳时间,以判断肾阳虚造模是否成 基因 mRNA 表达水平以及心脏组织中 TLR3、TLR7、
功 。然后,参照文献[21]中滴鼻方法并结合实际调整 MyD88、Caspase-3 mRNA表达水平。以甲型H1N1流感
[20]
剂量后,对造模组小鼠按 20 μL/只滴鼻接种甲型 H1N1 病毒感染小鼠后其肺组织中 M 基因 mRNA 的表达水平
中国药房 2021年第32卷第6期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 6 ·671 ·