Page 37 - 《中国药房》2021年第6期
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（批号20190123）购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司；                       流感病毒鸡胚尿囊液（血凝滴1∶640）以建立肾阳虚外感
        苯甲酸雌二醇（批号151102）购自宁波第二激素厂；磷酸                       复合模型，并以其出现精神萎靡、畏寒肢冷、形体消瘦、
        奥司他韦胶囊（批号J20140121，规格75 mg）购自上海罗                   体质量和肛温明显降低以及呼吸短促、打喷嚏等症状为
        氏制药有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂                         造模成功的外在表现。将造模成功的小鼠按体质量和
        盒（批号 120219200908）购自上海碧云天生物技术有限                    肾阳虚外感程度均分为3组，即模型组、阳性药组和麻黄
        公司；动物组织总 RNA 提取试剂盒（批号 R6927）、                      细辛附子汤组，每组12只。
        FastQuant cDNA 第一链合成试剂盒（批号 S7806）、Su-              2.3 给药
        perReal 荧光定量预混试剂-增强版试剂盒（批号 S7918）                      肾阳虚外感复合模型建立 24 h 后，进行给药干预。
        均购自天根生化科技有限公司；小鼠 Cyt-C 酶联免疫吸                       阳性药组小鼠给予磷酸奥司他韦胶囊 0.195 g/kg（人临
        附测定（ELISA）检测试剂盒（批号20191130）、Cyt-CO活                床等效剂量，以水为溶剂溶解），麻黄细辛附子汤组小鼠
        性测定试剂盒（批号 20191202）均购自南京建成生物工                      给予麻黄细辛附子汤1.802 g/kg（以生药总量计，人临床
        程研究所；PCR扩增引物由北京六合华大基因科技有限                          等效剂量），正常组和模型组小鼠给予等体积生理盐
        公司设计、合成；其余试剂均为分析纯或实验室常用规                           水。各组小鼠均灌胃相应药液或生理盐水，灌胃体积均
        格，水为超纯水。                                           为20 mL/kg，每天1次，连续6天。
        1.3 动物                                             2.4 小鼠一般情况观察
            健康 SPF 级雄性 Balb/c 小鼠共 48 只，体质量为                    造模期间，每天观察小鼠的精神状况、活动状态，并
                                                                                                 [19]
       （18±2）g，由山东朋悦实验动物繁育有限公司提供，生                         测定其自主活动次数和 5％负重游泳时间 。给药期
        产许可证号为 SCXK（鲁）2014-0007。动物饲养环境温                    间，每日测量小鼠体质量、肛温，记录其一般体征变化。
        度为（22±2）℃、相对湿度为 40％～60％，饲以普通饲                      将给药前小鼠的体质量定义为初始体质量，计算初始体
        料和无菌水。本研究中的动物实验方案均符合山东中                            质量百分率：初始体质量百分率（％）＝体质量（g）/初始
        医药大学动物伦理委员会标准。                                     体质量（g）×100％。
        1.4  病毒                                            2.5  小鼠脏器指数测定
            甲型 H1N1 流感病毒鼠肺适应株 FM1 由中国疾病                        末次给药 24 h 后，脱颈椎处死小鼠，取其脾、胸腺、
        预防控制中心病毒病预防控制所提供。                                  肺组织，称定质量，计算各脏器指数：脏器指数＝脏器质
        2 方法                                               量（mg）/体质量（10 g）。
        2.1  麻黄细辛附子汤的制备                                    2.6  小鼠肺组织病理学观察
            参照本课题组前期建立的提取方法制备麻黄细辛                              取小鼠肺组织适量于 4％多聚甲醛溶液中固定 24
        附子汤   [17－18] 。称取细辛30 g（最粗粉），加水240 mL浸泡            h，常规石蜡包埋、切片（约4 μm），进行常规苏木精-伊红
        30 min后，进行回流提取，提取液经八层纱布滤过，收集                       （HE）染色，然后在光学显微镜下观察小鼠肺组织病理
        滤液，记为细辛单煎液；同时收集蒸馏馏分，将馏分上样                          学变化。
        到AB-8大孔树脂柱上进行富集纯化，以50％乙醇洗脱，                        2.7  小鼠肺组织中病毒载量和心脏组织中 TLR3、
        洗脱液经浓缩后，加入等体积乙醚萃取，收集萃取部位，                          TLR7、MyD88、Caspase-3 mRNA表达水平测定
        然后用β-环糊精包合（每 1 mL 挥发油用β-环糊精 6 g 包                      采用实时荧光定量 PCR 法进行测定。取小鼠肺组
        合）得到细辛挥发油环糊精包合物0.72 g。取麻黄30 g、                     织和心脏组织各15～20 mg，分别按动物组织总RNA提
        附子 60 g，加水 360 mL 浸泡 30 min，然后与细辛单煎液               取试剂盒说明书方法进行总RNA提取。采用紫外-可见
        合并，煎煮 3 次，3 次煎煮的加水量分别为 360、300、300                 分光光度计测定 RNA 的浓度和纯度后，取光密度比值
        mL，煎煮时间分别为 60、30、30 min，分别以八层纱布滤                   （OD260 nm/OD280 nm ）在1.8～2.1之间的样品，根据FastQuant
        过，收集滤液。合并3次滤液，减压浓缩至340 mL，冻干                       cDNA 第一链合成试剂盒说明书进行操作，在基因扩增
        成粉末13.77 g。将冻干粉末13.77 g与细辛挥发油环糊                    仪中（42 ℃孵育15 min；95 ℃孵育3 min；4 ℃冷却）逆转
        精包合物0.72 g溶于水24 mL中，即得麻黄细辛附子汤，                     录得到cDNA。以cDNA为模板采用两步法进行PCR扩
        4 ℃保存，备用。                                          增。反应体系（共 20 μL）包括 2×SuperReal PreMix Plus
        2.2 分组与造模                                          （含SYBR Green I）10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物
            将小鼠随机分为正常组（12 只）和造模组（36 只）。                    各 0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。反应条件为 95 ℃
        造模组小鼠先腹腔注射苯甲酸雌二醇溶液（8 mg/kg）7                       预变性 15 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃延伸 32 s，共 40 个
                                     [19]
        天（每天 1 次）以复制肾阳虚模型 。于造模第 7 天时，                      循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用
        从造模的36只小鼠中随机选择12只检测其自主活动次                          2 －ΔΔCt 法计算各组小鼠肺组织中甲型 H1N1 流感病毒 M
        数和 5％负重游泳时间，以判断肾阳虚造模是否成                            基因 mRNA 表达水平以及心脏组织中 TLR3、TLR7、
        功 。然后，参照文献[21]中滴鼻方法并结合实际调整                         MyD88、Caspase-3 mRNA表达水平。以甲型H1N1流感
          [20]
        剂量后，对造模组小鼠按 20 μL/只滴鼻接种甲型 H1N1                     病毒感染小鼠后其肺组织中 M 基因 mRNA 的表达水平


        中国药房    2021年第32卷第6期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 6  ·671 ·
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