Page 81 - 《中国药房》2021年5期

得不同药物作用后的红色毛癣菌生物被膜样品，于液氮 表 2 不同培养基、不同初黏附时间下红色毛癣菌生物
中保存，备测。 被膜代谢活性的比较（x±±s，n＝10）
取上述待测红色毛癣菌生物被膜样品100 mg，加入 Tab 2 Comparison of metabolic activities of T. ru-
TRIzol试剂1 mL研磨，然后加入氯仿0.2 mL，振荡后于 brum biofilm in different culture mediums at
4 ℃条件下放置3 min，再以12 000 r/min离心15 min，取 different initial adhesion periods（x±±s，n＝10）
上清液至 EP 管中，加入等体积异丙醇混匀；弃上清，加 OD值
初黏附时间，h
入 DEPC 处理过的 75％乙醇溶液洗涤沉淀后，于 4 ℃条 不含FBS的RPMI-1640培养基 10％FBS的RPMI-1640培养基
0 0.610 7±0.068 0.590 3±0.090 ##
件下以8 000 r/min离心5 min，弃去上清，沉淀于室温下 3 0.693 0±0.067 1.011 1±0.093 ＊＊#
晾干后，加入30 µL DEPC处理过的ddH2O溶解RNA；取 6 0.651 0±0.098 1.122 3±0.038 ＊＊
12 0.315 7±0.025 0.665 8±0.068 ＊＊##
RNA溶液1.5 µL于超微量紫外分析仪中测定浓度后，置
24 0.640 9±0.088 0.441 8±0.077 ##
于－80 ℃冰箱中保存，备用。以上述总 RNA 4 μg 为模 96 0.644 8±0.046 0.553 8±0.057 ##
板，按照Bestar TM qPCR RT试剂盒说明书方法将总RNA 注：与不含FBS的RPMI-1640培养基比较， P＜0.01；与6 h初黏
＊＊
##
#
逆转录成 cDNA。采用荧光定量 PCR 仪进行扩增，PCR 附时间比较，P＜0.05，P＜0.01
Note：vs. RPMI-1640 medium without FBS， P＜0.01；vs. initial
＊ ＊
反应体系（共20 µL）为：Bestar SybrGreen qPCR master-
®
adhesion time of 6 h，P＜0.05，P＜0.01
#
##
Mix 10 μ L，cDNA 模 板 1 μ L，上 下 游 引 物 各 0.5 μ L，
表3 PB对红色毛癣菌黏附过程的影响（x±±s，n＝5）
ddH2O 8 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min；94 ℃
Tab 3 Effects of PB on the adhesion process of T. ru-
变性 20 s，58℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，40 个循环。进
brum（x±±s，n＝5）
行融解曲线分析：94℃变性30 s，65 ℃退火30 s，94 ℃延
组别 相对黏附率，％
伸 30 s。上述试验均重复操作 3 次。以β-tubulin 为内参 生长对照组 100.00
基因，按照2 －ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量。 PB 40 μg/mL质量浓度组 88.95±0.070 ΔΔ
2.7 统计学方法 PB 80 μg/mL质量浓度组 36.72±0.052 ΔΔ
PB 160 μg/mL质量浓度组 16.91±0.016 ΔΔ
采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资 TBF 0.25 μg/mL质量浓度组 29.46±0.027 ΔΔ
料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比 TBF 0.5 μg/mL质量浓度组 31.23±0.030 ΔΔ
TBF 1 μg/mL质量浓度组 31.97±0.029 ΔΔ
较采用LSD法。P＜0.05表示差异有统计学意义。
ΔΔ
注：与生长对照组比较，P＜0.01
3 结果
ΔΔ
Note：vs. growth control group，P＜0.01
3.1 PB对红色毛癣菌药敏性的影响 3.4 PB对不同初黏附时间下红色毛癣菌生物被膜形成
PB、TBF 和 AMB 对红色毛癣菌的 MIC 分别为 20、 的影响
0.125、0.5 µg/mL；氟康唑对质控菌株近平滑念珠菌 不同初黏附时间下，生长对照组均有大量红色毛癣
ATCC-22019 的 MIC 为 2 µg/mL，符合质控要求，测试结 菌菌丝聚集成团，生物被膜结构致密。当初黏附3 h时，
果可信。 与生长对照组比较，PB 20、40 µg/mL质量浓度组菌丝数
3.2 红色毛癣菌生物被膜构建条件的筛选结果 量相对减少，PB 80 µg/mL 质量浓度组菌丝数量明显减
在相同初黏附时间（3、6、12 h）下，与不含 FBS 的 少、长度明显缩短；当初黏附5、9 h时，PB 20、40 µg/mL质
RPMI-1640 培养基比较，含 10％FBS 的 RPMI-1640 培养 量浓度组菌丝数量明显减少，PB 80 µg/mL质量浓度组未
基中红色毛癣菌生物被膜的 OD 值均显著升高（P＜ 发现明显菌丝，详见图1。与生长对照组比较，初黏附3 h
0.01），表明红色毛癣菌在含10％FBS的RPMI-1640培养 后，PB 20、40、80 µg/mL 质量浓度组红色毛癣菌生物被
基中的代谢活性增强，生物被膜的形成量明显增加。在 膜的黏附抑制率均显著升高（P＜0.05）；初黏附5、9 h后，
含 10％FBS 的 RPMI-1640 培养基中，与 6 h 的初黏附时 PB 20、40、80 µg/mL质量浓度组红色毛癣菌生物被膜的
间比较，其他初黏附时间（12、24、48 h）下红色毛癣菌生 黏附抑制率均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），详见表4。
物被膜的 OD 值均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），表明 3.5 PB 对 红 色 毛 癣 菌 生 物 被 膜 中 ERG6、ERG11
红色毛癣菌在含10％FBS培养基中初黏附6 h时的生物 mRNA表达的影响
被膜代谢活性最强，详见表3。 与生长对照组比较，TBF组红色毛癣菌生物被膜中
3.3 PB对红色毛癣菌黏附过程的影响 ERG6、ERG11 mRNA 的相对表达量均显著升高（P＜
药物作用 6 h 后，与生长对照组比较，PB 和 TBF 各 0.05）；AMB 组、PB 组红色毛癣菌生物被膜中 ERG6、
质量浓度组红色毛癣菌的相对黏附率均显著降低（P＜ ERG11 mRNA 的相对表达量均显著降低（P＜0.05 或
0.01），详见表3。 P＜0.01），详见表5。

中国药房 2021年第32卷第5期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5 ·587 ·