Page 80 - 《中国药房》2021年5期
P. 80

养基稀释，使药物质量浓度为 640 µg/mL，分别加入 96                     养直至 96 h 后，弃去原培养基，用无菌 PBS 轻轻冲洗 2
        孔板的第 1 列孔中（每孔 200 µL），在第 2～10 列孔中加                  次，于室温条件下干燥；每孔加入100 µL XTT-甲萘醌溶
        入 RPMI-1640 培养基 100 µL，然后从第 1 列孔中吸取                 液（XTT钠盐用PBS配制成0.5 mg/mL的饱和溶液，甲萘
        100 µL PB药液加入第2列孔中，充分混匀后吸取100 µL                    醌用丙酮配制成10 mol/L的溶液，然后两者按1∶10体积
        加入第 3 列孔中，依次进行倍比稀释 ；第 10 列孔中药                       比混匀而得），避光培养2 h后取出，将96孔板置于微量
                                        [14]
        液混匀后吸弃 100 µL；在第 11 列孔加入 RPMI-1640 培                振荡器上振荡 10 min，使染料分布均匀；吸取上述染色
        养基 100 µL 作为生长对照组（即不含药物），第 12 列孔                    后的菌悬液 100 µL 于新的 96 孔板中，用酶标仪于 490
        加入 RPMI-1640 液体培养基 200 µL 作为空白对照。除                  nm 波长处检测各孔 OD 值。另设置阳性对照药 TBF
        第12列孔不加入红色毛癣菌菌悬液外，其余各孔均加入                           0.25、0.5、1.5 µg/mL 质量浓度组（根据 TBF 的 2、4、8 倍
        2×10 个/mL 的菌悬液（使 PB 药液终质量浓度为 0.625、                 MIC 进行设置），按上述方法操作。然后根据公式计算
             4
        1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 µg/mL），于 35 ℃恒       红色毛癣菌的相对黏附率：相对黏附率（％）＝（OD 药物组－
        温培养箱中培养96 h，以肉眼观察96孔板中无菌生长的                         OD 空白对照组 ）/（OD 生长对照组－OD 空白对照组 ）×100％。
        孔 所 对 应 的 药 物 浓 度 作 为 PB 的 最 小 抑 菌 浓 度              2.5  PB 对不同初黏附时间下红色毛癣菌生物被膜形
        （MIC）。另取阳性对照药 TBF、AMB 同上述方法进行                       成的影响
        倍比稀释（终质量浓度分别为 0.003 9～2、0.062 5～8                       采用 XTT 法进行检测。以含 10％ FBS 的 RPMI-
                                                                                                    6
        μg/mL），按上述方法测定TBF、AMB的MIC。另以平滑                      1640 培养基将红色毛癣菌菌悬液调整为 1×10 个/mL，
        念珠菌标准菌株ATCC22019作为质控菌，以氟康唑作为                        按每孔100 µL分别接种至3个96孔板中，置于35 ℃恒温
        质控菌药物（终质量浓度为 0.0625～8 μg/mL），同上述                    培养箱中分别培养 3、5、9 h（该过程即为红色毛癣菌的
        方法测定氟康唑对平滑念珠菌的MIC，若氟康唑的MIC                          初黏附过程），然后用PBS轻轻冲洗2次，再将含菌孔板
        为0.5～4 µg/mL，则表明该方法可靠。以上试验操作均                       随机分为 PB 20、40、80 µg/mL 质量浓度组（根据 PB 的
        重复3次。                                               1、2、4 倍 MIC 进行设置），并加入相应药液；同时设置
        2.3  红色毛癣菌生物被膜构建条件筛选                                生长对照组（含菌悬液但不含药液）和空白对照组（只
            采用MTT法筛选构建红色毛癣菌生物被膜的培养                          含培养基），每组设5个复孔。将96孔板置于35 ℃恒温
        基和初黏附时间。分别以含或不含 10％FBS 的 RPMI-                      培养箱中培养直至 96 h，取出，于倒置显微镜下观察 PB
        1640培养基将红色毛癣菌菌悬液稀释至1×10 个/mL，按                      对不同初黏附时间下红色毛癣菌生物被膜黏附作用的
                                               6
        每孔100 µL接种至96孔板中，分别在35 ℃培养箱中培                       影响，并拍照记录。然后弃去培养基，以无菌 PBS 轻轻
        养 0、3、6、12、24、96 h（即初黏附时间，每种培养基各时                   冲洗 2 次，于室温条件下干燥后，每孔加入 XTT-甲萘
        间点均设置10个复孔），弃去上层培养基，用无菌PBS轻                         醌溶液 100 µL，避光培养 2 h 后取出，将 96 孔板置于微
        轻冲洗2次，再加入相应培养基100 µL后，继续于35 ℃                       量振荡器上振荡 10 min，使染料分布均匀；吸取上述染
        恒温培养箱中培养直至 96 h；弃去上层培养基，用无菌                         色后的菌悬液 100 µL 到新的 96 孔板中，用酶标仪于
        PBS 轻轻冲洗 2 次，室温干燥后，加入 5 mg/mL MTT 溶                 490 nm 波长处检测各孔 OD 值，并计算不同初黏附时
        液 20 µL，置于35 ℃恒温培养箱中避光培养4 h后，再加                     间下对红色毛癣菌的黏附抑制率：黏附抑制率（％）＝
        入 DMSO 150 µL，低速振荡 10 min；吸取上述菌悬液                   [1－（OD 药物组－OD 空白对照组）/（OD 生长对照组－OD 空白对照组）]×
        100 µL 到新孔板中，采用酶标仪于 510 nm 波长处检测                    100％。
        各孔的光密度（OD）值。OD值越高，表明红色毛癣菌生                          2.6  PB 对 红 色 毛 癣 菌 生 物 被 膜 中 ERG6、ERG11
        物被膜中孢子代谢活性越高，即该条件越优。                                mRNA表达的影响
        2.4  PB对红色毛癣菌黏附过程的影响考察                                  根据“2.2”项下筛选的条件，以含10％FBS的RPMI -
                                                                                                   6
            采用 XTT 法进行检测。以含 10％FBS 的 RPMI-                  1640培养基将红色毛癣菌菌悬液稀释成1×10 个/mL，按
        1640培养基将红色毛癣菌菌悬液调整为1×10 个/mL，然                      每孔 2 mL 接种至 6 孔板中，置于 35 ℃恒温培养箱中培
                                               6
        后按每孔100 µL接种至96孔板中，随机分为PB 40、80、                    养6 h后，吸弃上层培养基，用无菌PBS轻轻冲洗3次，然
        160 µg/mL质量浓度组（根据PB的2、4、8倍MIC进行设                    后加入 2 mL 含 10％FBS 的 RPMI 1640 培养基，继续于
        置），并加入相应药液 100 µL；同时设置生长对照组（含                       35 ℃恒温培养箱中培养至 96 h；弃去上层培养基后，分
        菌悬液但不含药物）和空白对照组（只含培养基），每组                           别加入含 PB 和阳性对照药 TBF、AMB 的培养基（终质
        均设5个复孔。将96孔板于35 ℃恒温培养箱中培养6 h                        量浓度均分别为 320、2、8 µg/mL，每种药物设置 3 个复
        后，用无菌PBS轻轻冲洗2次；加入新鲜的含10％FBS的                        孔）2 mL，置于 35 ℃恒温培养箱中培养 48 h 后，用 4 ℃
        RPMI 1640培养基100 µL，继续于35 ℃恒温培养箱中培                   的 PBS 清洗 2 次，以 1 000 r/min 离心 10 min，弃上清，即


        ·586 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5                                    中国药房    2021年第32卷第5期
   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85