Page 79 - 《中国药房》2021年5期
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近年来，浅部真菌病的发病率持续增加，对人们健                         式反应（qRT-PCR）仪（美国 Agilent 公司），K960 型 PCR
        康产生重大影响 。红色毛癣菌 Trichophyton rubrum 是               扩增仪（杭州晶格科学仪器有限公司），血细胞计数板
                      [1]
        临床最常见的皮肤癣菌，为浅部真菌病的主要病原菌，                           （上海市求精生化试剂仪器有限公司），Q6000UV型超微
                                                  [2]
        有69.5％的皮肤癣菌病是由红色毛癣菌感染所致 。目                         量紫外分析仪（美国Quawell Technology公司），SW-CJ-1
        前，临床上常用的抗真菌药包括三唑类、多烯类、棘白菌                          型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。
              [3]
        素类等 。抗真菌药的大量使用不仅对人体的毒副作用                           1.2 主要药品与试剂
        较大，而且长期使用也会导致病原菌耐药性的产生，例                               本研究所用主要药品与试剂有：PB（本实验室自
                                   [4]
        如红色毛癣菌对特比奈芬耐药 、白色念珠菌对氟康唑                           制，纯度＞98％），特比萘芬（TBF）、甲萘醌（大连美仑生
        耐药 ，严重影响患者的治疗效果。有研究表明，抗真菌                          物技术有限公司，批号分别为 M0726A、C1517035），两
            [5]
        药物耐药性的耐药性产生与生物被膜的形成密切相                             性霉素 B（AMB，美国 AMRESCO 公司，批号 A0414，纯
          [6]
        关 。然而，关于红色毛癣菌生物被膜耐药的问题，目前                          度＞98％），氟康唑（北京索莱宝科技有限公司，批号
        研究报道甚少。                                            504B041，纯度＞98％），MTT 试剂（广州瑞舒生物科技
            麦角甾醇是真菌生长必需的重要成分，其能与磷酸                         有限公司，批号201612），XTT钠盐（美国Sigma公司，批
        结合起到保护细胞膜稳定性的作用，对细胞膜结构的稳                           号 CX28143704），RPMI-1640 培养基（美国 Gibco 公司，
        定性、流动性以及膜结合酶的活性具有重要作用 。一                           批号1786045），胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份
                                                  [7]
        旦出现麦角甾醇缺失的情况，细胞膜的稳定性就会下                            有限公司，批号19110506），二甲基亚砜（DMSO，天津大
                                                           茂化学试剂厂，批号 2019030121），丙酮（衡阳市凯信化
        降，从而导致细胞膜破裂和细胞内物质外流，引起真菌
                                                           工有限公司有限公司，批号0601142），Bestar           TM  qRT-PCR
        细胞死亡 。在麦角甾醇的合成过程中，有 4 个重要的
                [8]
                                                           试剂盒、BestarTM qPCR MasterMix试剂盒（德国DBI公
        环节，分别是甲羟戊酸的生物合成、甲羟戊酸转化为角
                                                           司，货号分别为 2220、2043），TRIzol 试剂（日本 TaKaRa
        鲨烯、角鲨烯形成羊毛甾醇、羊毛甾醇转化为麦角甾
                                                           公司，货号 9109），焦碳酸二乙酯（DEPC，上海麦克林生
          [9]
        醇 。其中，ERG6 是C-24位甲基转移酶上的编码基因，
                                                           化科技有限公司，货号 6079），PCR 引物（由上海生工生
        其 mRNA 的高表达不仅可以补偿其他高表达基因对麦
                                                           物工程有限公司合成，引物序列及产物长度信息见表
        角甾醇带来的负反馈作用，同时还可以进一步提高麦角
                                                           1）；其余试剂为分析纯或实验室常用规格，水为超
        甾醇的含量 。14-α去甲基酶是麦角甾醇合成通路中的
                  [10]
                                                           纯水。
        关键酶，抑制该酶活性，可阻止羊毛甾醇的去甲基化，使
                                                                      表1 引物序列及产物长度信息
        其终产物麦角甾醇缺失，从而破坏细胞的完整性，进而
                                                                    Tab 1 Primer sequence and length
        抑制真菌生长 。
                    [11]
                                                           基因                   引物序列                产物长度，bp
            香鳞毛蕨Dryopteris fragrans（L.）Schott是鳞毛蕨科
                                                           β-tubulin    上游：5′-GCATCTTTTGTTGGCACCGT-3′  278
        鳞毛蕨属植物，具有抗菌、抗肿瘤、止痒、抗过敏等多种                                       下游：5′-TACCGGGCTTCAAATGTCCC-3′
        功效，在民间被广泛用于治疗多种皮肤病（如体癣、手足                          ERG6         上游：5′-CTCTGGCAAGACACGAACAC-3′  126
                                                                        下游：5′-CCTTGCAGCCGGTGAAGG-3′
                            [12]
        癣等），均有较好的效果 。本课题组前期研究发现，香                          ERG11        上游：5′-CCGGCTTCAGGCATACCAA-3′  103
        鳞毛蕨中的单体化合物异黄绵马酸PB（简称“PB”）对红                        1.3  菌株
                                                     [13]
        色毛癣菌及其生物被膜成熟期均有较强抑制作用 。                                本研究所用红色毛癣菌临床菌株 YAMA-786、近平
        基于此，本研究以红色毛癣菌为研究对象，初步分析PB                          滑念珠菌标准菌株ATCC-22019均由中国医学科学院皮
        对红色毛癣菌生物被膜黏附及甾醇代谢相关酶基因                             肤病研究所提供。
       （ERG6、ERG11）表达等的影响，为深入研究 PB 抗红色                     2 方法
        毛癣菌生物被膜的作用及机制提供实验依据。                               2.1 红色毛癣菌菌悬液的制备
        1 材料                                                   取红色毛癣菌临床菌株 YAMA-786，于超净工作台
        1.1 主要仪器                                           中接种在马铃薯固体培养基的试管斜面上，置于 28 ℃
            本研究所用主要仪器有：PB-10 型台式数显 pH                      恒温箱中培养14天后，连续传代2次得到红色毛癣菌实
        计[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，BA310 型正置                      验菌株；然后采用接种环轻刮菌落置于研磨器中，加入
        显微镜、AE2000型倒置显微镜（麦克奥迪实业集团有限                        无菌磷酸盐缓冲液（PBS）1 mL，研磨成菌悬液，经血细
        公司），iMark型酶标仪（美国Bio-Rad公司），DHP-9032B               胞计数板计数后，用RPMI-1640液体培养基将菌悬液浓
        型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），                            度调至1×10 个/mL，备用。
                                                                      6
        CHA-S型恒温振荡器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限                         2.2 PB对红色毛癣菌药敏性的影响考察
        公司），Strat-agene Mx3000P 型实时荧光定量聚合酶链                    采用 M38-A2 法进行检测。取 PB 以 RPMI-1640 培


        中国药房    2021年第32卷第5期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5  ·585 ·
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