Page 67 - 《中国药房》2021年5期
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2.1.3  分组与给药       分别取按“2.1.1”“2.1.2”项下方法          消化15 min，用小牛血清中止消化，滤过，将消化后的组
        成功复制 H22实体瘤和腹水瘤模型的荷瘤小鼠各 50 只，                      织液以2 000 r/min反复离心2 min×3次，收集沉淀，加入
        均随机分为阴性对照组、阳性对照组（羟基喜树碱 6                           0.85％NH4Cl 溶液 1 mL 以破除血细胞，再以 1 500 r/min
        mg/kg，剂量设置参考文献[22]和预实验结果）和石蒜碱                      离心5 min，收集沉淀，即得正常小鼠肝细胞，待用。
        低、中、高剂量组（石蒜碱 10、20、40 mg/kg，剂量设置参                  2.2.3  石蒜碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞线粒体膜通透性
        考文献[22]和预实验结果），每组 10 只。阴性对照组小                      影响的检测        按“2.2.2”项下方法收集正常对照组小鼠
        鼠腹腔注射生理盐水0.2 mL，各给药组小鼠腹腔注射相                        肝细胞和其余各组小鼠肿瘤细胞适量，用 Reagent A 溶
        应药液[均以磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制，下同]0.2                  液混匀，以2 000 r/min离心10 min，弃去上层清液，沉淀
        mL，每天 1 次，连续给药 7 天。实验期间所有小鼠均正                      加入Calcein AM染料避光染色20 min，以1 000 r/min离
        常摄食、饮水。                                            心10 min，弃去上层清液，沉淀（即受试细胞）用Reagent
        2.1.4  石蒜碱对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的检测                使用实       A 溶液清洗后，再加入该溶液 500 μL，吹打并混匀。精
        体瘤小鼠模型进行实验。末次给药24 h后，称定小鼠体                         确吸取该细胞混悬液100 μL，采用激光共聚焦扫描显微
        质量，以颈椎脱臼法将其处死并以仰卧位固定，于胸部                           镜观察，以检测到的荧光强度（即FI值）来反映细胞的粒
        消毒后，在其右前肢腋窝处将瘤体剥离；称定瘤体质量，                          体膜通透性，FI值越大则其线粒体膜通透性越低。
        并计算石蒜碱抑瘤率：抑瘤率＝（阴性对照组平均瘤体                           2.2.4  石蒜碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞线粒体膜电位变
        质量－给药组平均瘤体质量）/阴性对照组平均瘤体质                           化影响的检测         按“2.2.2”项下方法收集正常对照组小
        量×100％。                                            鼠肝细胞和其余各组小鼠肿瘤细胞适量，用PBS吹打并
        2.1.5  石蒜碱对H22荷瘤小鼠生存时间影响的检测                  使     清洗 1 次，避光加入 Rhodamine 123 染料，避光孵育 30
        用腹水瘤小鼠模型进行实验。末次给药后，记录各组小                           min，以2 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀（即受
        鼠的平均生存时间，观察时间设定为30天（若小鼠生存
                                                           试细胞）经PBS清洗2次后，用PBS 400 μL重悬，并使用
                                     [23]
        超过此时间，则按30天进行计算） ，计算小鼠生命延长
                                                           激光共聚焦扫描显微镜观察，以检测到的FI值来反映细
        率：生命延长率＝（给药组平均生存天数－阴性对照组
                                                           胞的线粒体膜电位，FI值越大则其线粒体膜电位越高。
        平均生存天数）/阴性对照组平均生存天数×100％。                          2.2.5  石蒜碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞内Caspase-3蛋白
        2.1.6  石蒜碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞早期凋亡影响的                      活性影响的检测          按“2.2.2”项下方法收集正常对照组
        检测    使用腹水瘤小鼠模型进行实验，以流式细胞术检                        小鼠肝细胞和其余各组小鼠肿瘤细胞适量，用PBS吹打
        测。（1）肿瘤细胞收集：于末次给药次日（于处死前），用                        并清洗 1 次，以 2 000 r/min 离心 10 min，弃去上清液，沉
        注射器于小鼠腹腔中抽取腹水1 mL，以2 000 r/min离心
                                                           淀加入裂解液适量，于冰浴中裂解 15 min；于 4 ℃下以
        10 min后，弃去上层清液；沉淀用0.85％NH4Cl溶液洗涤
                                                           16 000 r/min 离心 15 min，取上层清液，使用比色法以酶
        3次，然后再用生理盐水洗涤3次，再以2 000 r/min离心
                                                           标仪检测 Caspase-3 蛋白的活性（严格按相应试剂盒说
        10 min，弃去上层清液，即得肿瘤细胞，待用。（2）细胞早
        期凋亡率检测：将上述 H22荷瘤小鼠的肿瘤细胞用 PBS                       明书操作）。
        吹打并清洗 1 次，以 2 000 r/min 离心 5 min，弃去上层清             2.2.6  石蒜碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞内凋亡相关蛋白
        液，沉淀用－20 ℃的 70％乙醇重悬后于 4 ℃固定 24 h；                  表达影响的检测          采用 Western blot 法检测。按“2.2.2”
        随后，以 2 000 r/min 离心 10 min，弃去上层清液，沉淀               项下方法收集正常对照组小鼠肝细胞和其余各组小鼠
                                                           肿瘤细胞适量，用PBS清洗1次，彻底吸弃PBS溶液后，
       （即肿瘤细胞）避光加入PI染液800 μL，轻轻吹打、混匀，
                                                           加入裂解液适量，于冰浴中裂解 15 min，再于 4 ℃下以
        于室温下避光孵育 30 min，滤过，使用流式细胞仪检测
        细胞的早期凋亡率。                                          16 000 r/min 离心 15 min，取上层清液置于－80 ℃条件
        2.2  石蒜碱对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞线粒体膜功能影响                       下保存，待用。经考马斯亮蓝法测定该上层清液中的蛋
        的研究                                                白含量后，加入适量 SDS-PAGE 上样缓冲液，于 100 ℃
        2.2.1  分组与给药      取接种成功的腹水瘤模型小鼠 50                 变 性 5 min。 取 变 性 后 的 蛋 白 样 品 适 量 ，行 15％
        只，按“2.1.1”项下方法分为阴性对照组、阳性对照组（羟                      SDS-PAGE。电泳后转膜，以脱脂奶粉封闭 2 h，然后加
        基喜树碱，6 mg/kg）和石蒜碱低、中、高剂量组（10、20、                   入 Bcl-2、Bax、Cyc-C、Caspase-9、β-actin 一抗（稀释度均
        40 mg/kg），每组10只；同时取10只不荷瘤的正常小鼠作                    为 1 ∶ 200），于 4 ℃下孵育过夜；依次用 TBST 溶液、TBS
        为正常对照组。阴性对照组和正常对照组小鼠腹腔注                            溶液在室温下洗涤 10 min×2 次、10 min×1 次后，加入相
        射生理盐水 0.2 mL，各给药组腹腔注射相应药液 0.2                      应二抗（稀释度为1∶500），室温孵育2 h；依次用TBST溶
        mL，每天 1 次，连续给药 7 天。实验期间所有小鼠均正                      液、TBS溶液在室温下洗涤10 min×2次、10 min×1次，以
        常摄食饮水。                                             AP-NBT/BICT 显色液显色，再置于凝胶成像系统上成
        2.2.2  细胞收集 （1）肿瘤细胞：方法同“2.1.6（1）”项。                像。使用 Image G v2.8.7 软件分析，以 Cyc-C、Caspase-9
       （2）正常小鼠肝细胞：取正常对照组小鼠肝组织适量并                           蛋白与内参β-actin 的灰度值比值表示上述蛋白的表达
        切成小块，用PBS清洗后放入试管中，加入胰酶于37 ℃                        水平，并记录Bcl-2/Bax的灰度值比值。


        中国药房    2021年第32卷第5期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 5  ·573 ·
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