Page 91 - 《中国药房》2021年第4期
P. 91

测各孔的光密度（OD）值并计算细胞增殖抑制率：增殖                          均值×100％。实验重复3次。
        抑制率＝（空白对照组OD值－给药组OD值）/空白对照                         2.5 GL63对RBE细胞侵袭的影响考察
        组OD值×100％；采用SPSS 13.0软件根据药物浓度和细                        采用 Transwell 小室侵袭实验进行检测。将对数生
        胞增殖抑制率计算 GL63 的半数抑制浓度（IC50 ）。试验                    长期RBE细胞以0.25％胰酶消化后，按1.5×10 个/mL接
                                                                                                   5
        重复3次。                                              种于 Transwell 小室上室（铺有基质胶，加入菌液体积为
        2.2 GL63对RBE细胞集落形成的影响考察                            0.5 mL），下室加入等体积完全培养基，然后上下室均分
            采用结晶紫法进行检测。将对数生长期 RBE 细胞                       别加入含不同浓度 GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培
        以0.25％胰酶消化后，以500个/孔接种于6孔板中，培养                      养基，继续培养 24 h。培养结束后，用棉签擦去上室漂
        待其贴壁后，弃去培养基。将细胞分组并分别加入含不                           浮的细胞，再用4％多聚甲醛溶液固定细胞15 min，再浸
        同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L，剂量根据“2.1”项MTT             入结晶紫试液中染色 20 min，在倒置相差显微镜（100
        法试验和本课题组前期预试验结果设置，下同）的完全                           倍）下随机选取5个视野进行拍照并对细胞进行计数，取
        培养基继续培养48 h后取出，持续替换新鲜的完全培养                         平均值。实验重复3次。
        基培养14 d使细胞形成集落。培养结束后，细胞用磷酸                         2.6 GL63 对 RBE 细胞中 JAK2/STAT3 信号通路肿瘤
        盐缓冲液（PBS，pH＝7.4）洗涤，并用 4％多聚甲醛溶液                     相关蛋白表达的影响考察
        固定 20 min，再以 1％结晶紫试液染色。在倒置相差显                          采用 Western blotting 法进行检测。将对数生长期
        微镜下观察细胞增殖形成的集落，对其进行计数并计算                           RBE 细胞按照“2.3”项下方法消化、接种、培养，分别加
        集落形成抑制率：集落形成抑制率（％）＝给药组集落均
                                                           入含不同浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，
        数/空白对照组集落均数×100％。试验重复3次。                           继续培养 24 h；弃去培养液，加入蛋白裂解液冰浴裂解
        2.3 GL63对RBE细胞周期分布和凋亡的影响考察
                                                           25 min 后，收集细胞裂解液，于 4 ℃下以 15 000 r/min 离
            采用流式细胞术对细胞周期分布和凋亡情况进行
                                                           心 30 min，收集上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度。上
        检测。将对数生长期RBE细胞以0.25％胰酶消化后，以
                                                           清液经蛋白上样缓冲液稀释后，于 100 ℃下变性 5
        1×10 个/孔接种于6孔板中，培养24 h待细胞贴壁后，弃                     min。取变性后的蛋白适量，进行 12％聚丙烯酰胺凝胶
            5
        去培养基。将细胞分组并分别加入含不同浓度 GL63
                                                           电泳，随后转移至 PVDF 膜上；用 5％脱脂牛奶封闭后，
       （0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养24 h，然后                加 入 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、Bax、
        收集、洗涤细胞。在细胞中先后加入 Annexin Ⅴ-FITC、
                                                           MMP-2、MMP-9、Cyt-c、Pro-caspase-9、Cleaved-cas-
        PI 试剂各 5 μL，混匀，于室温下避光反应 15 min 后，用
                                                           pase-9、Pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3 和 GAPDH 一抗
        流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡检测。试验重复
                                                           （稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育过夜；以 TBST 缓冲
        3 次。
                                                           液洗膜，加入二抗（稀释度为1 ∶ 500），室温下孵育2 h；以
            另采用 Hoechst 33342 染色法对细胞凋亡情况进行
                                                           TBST 缓冲液洗膜经 ECL 化学发光试剂处理后，使用凝
        检测。将对数生长期RBE细胞以0.25％胰酶消化后，按
                                                           胶成像分析系统采集图像。采用 Image J 5.0 软件分析
        1×10 个/孔接种于 6 孔板中，盖上盖玻片培养 24 h 使细
            5
        胞贴壁后，弃去培养基。将细胞分组并分别加入含不同                           相应目标蛋白条带与内参 GAPDH 条带的灰度值之比，
                                                           用来表示目标蛋白的表达水平。试验重复3次。
        浓度GL63（0、5、10、20 μmol/L）的完全培养基，继续培养
                                                           2.7  统计学方法
        48 h。吸弃上清液，用PBS清洗2次后，每孔加入固定液
                                                               采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资
        固定 10 min；以 PBS 漂洗 3 次后，滴加 Hoechst 33342 蓝
                                                           料以 x±s 表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，
        色荧光染料100 μL，室温放置10 min；用PBS清洗3次再
                                                           组间两两比较采用 LSD-t 检验。P＜0.05 表示差异有统
        晾干后，以340 nm波长的紫外光激发，在倒置荧光显微
                                                           计学意义。
        镜下观察并拍照。
        2.4 GL63对RBE细胞迁移的影响考察                              3 结果
            采用划痕实验进行检测。将对数生长期 RBE 细胞                       3.1 GL63对RBE细胞增殖的影响
        以0.25％胰酶消化后，按1×10 个/孔接种于6孔板中，培                         结果显示，与空白对照组比较，经不同浓度 GL63
                                 5
        养24 h待其融合至90％，采用尖端粗细相同的无菌枪头                        （1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L）作用48 h后，细胞的增殖
        垂直划线；用 PBS 清洗除去悬浮的细胞后，将余下细胞                        抑制率均显著升高（P＜0.01），分别为（6.58±1.21）％、
        分组并分别加入含不同浓度 GL63（0、5、10、20 μmol/L）                （15.28±1.64）％、（33.66±1.92）％、（52.53±2.16）％、
        的完全培养基，继续培养 24 h。然后，于倒置相差显微                        （76.25±2.63）％、（92.28±3.67）％，且这一抑制作用有
        镜下观察划痕距离，每个样品随机选取5个视野，分别测                          随着药物浓度升高而逐渐升高的趋势，详见图 1。经计
        量并计算初始划痕时和加药培养完毕后的划痕距离的                            算，GL63对RBE细胞的IC50为（8.46±1.30）μmol/L。
        差值（即细胞迁移距离）并取平均值。计算细胞迁移愈                           3.2 GL63对RBE细胞集落形成的影响
        合率：迁移愈合率＝细胞迁移距离平均值/初始划痕距离                              结果显示，与空白对照组比较，不同浓度 GL63 组


        中国药房    2021年第32卷第4期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 4  ·469 ·
   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95   96