Page 66 - 《中国药房》2021年3期
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于 75 ℃水浴中蒸发浓缩，制成质量浓度为 1 g/mL 的番                     2.6 海马组织中BDNF和血清中5-HT水平的检测
        泻叶水煎浓缩液（以生药量计，下同），并于 4 ℃保存备                             最小疼痛阈值检测后，对各组小鼠吸入过量乙醚处
        用，临用时将其用水稀释至0.3 g/mL。                               死，收集其海马组织及腹主动脉血。将各组小鼠腹主动
            将小鼠分为空白对照组（生理盐水）、模型组（生理                         脉血以3 000 r/min离心15 min后，取上清液作为待测血
        盐水）、参苓白术散组（3.6 g/kg，剂量参考本课题组前期                      清样本；称取各组小鼠海马组织10 mg，于冰上充分研磨
        预实验结果设置），每组8只。除空白对照组外，模型组                           后，以 3 000 r/min 离心 15 min，取上清液作为海马组织
        和参苓白术散组小鼠参考文献[20]造模。具体操作如                           待测样本。按照ELISA试剂盒说明书方法操作，采用酶
        下：小鼠每天皮下注射皮质酮（20 mg/kg），连续 4 周，于                    标仪于 450 nm 波长处检测海马组织中 BDNF 和血清中
        第2周起，每天禁食不禁水12 h后，灌胃给予番泻叶水煎                         5-HT的水平。
        液，然后使用胶带束缚其四肢、胸部及肩部 1 h；每天皮                         2.7  肠道微生物 DNA 的提取、测序及丰度和多样性
        下注射、灌胃及束缚各1次，持续操作3周。当小鼠出现                           分析
        明显精神不振、喜卧恶动并伴有腹泻的情况时，则表明                                各组小鼠收集海马组织后，分别取 3 只置于无菌条
        造模成功。造模成功后，各组小鼠灌胃给予相应药物或                            件下，提取其盲肠内容物样品，委托北京百迈客生物科
        生理盐水，连续给药4周。                                        技有限公司进行DNA提取及16S rDNA高通量测序，并
        2.2 腹泻情况和体质量测定                                      统计数据处理各阶段样品序列条目；分析各组小鼠肠道
            末次给药后，采用滤纸印迹法 测定并记录各组小
                                      [21]
                                                            微生物丰度和多样性的差异，使用USEARCH 10.0软件
        鼠 6 h 内排便的总数以及稀便数（根据滤纸上有无污迹
                                                                                                     [24]
                                                            在相似性97％（默认）的水平上对序列进行聚类 ，默认
        判断），并计算稀便率（稀便率＝稀便数/粪便总数×
                                                            以测序所有序列数的 0.005％作为阈值过滤 OTUs。利
        100％）。根据滤纸上粪便污迹直径对稀便进行分级（1
                                                            用Alpha多样性分析法 分析各组小鼠盲肠内容物的稀
                                                                                [25]
        级：污迹直径＜1 cm；2级：污迹直径1～＜2 cm；3级：污
                                                            释曲线（测序条数作为横坐标，并基于此测序条数经
        迹直径2～＜3 cm；4级：污迹直径3～＜4 cm；5 级：污迹
                                                            OTU 聚类后得到 OTU 数量作为纵坐标）、Shannon 指数
        直径 4～＜5 cm）并计算腹泻指数（腹泻指数＝稀便率×
                                                            曲线（测序条数作为横坐标，Shannon指数作为纵坐标）、
        稀便分级） 。同时，测量各组小鼠的体质量。
                 [21]
                                                            等级丰度曲线（OTU 数量作为横坐标，相对丰度作为纵
        2.3  糖水偏好百分比的测定
                                                            坐标；若曲线越平滑下降则表明样本的多样性高，曲线
            末次给药后，将各组小鼠禁水不禁食 24 h，然后单
                                                            越陡然下降则表明样本的多样性低）。基于 QIIME
        笼放置进行糖水偏好实验。每笼小鼠同时供应2％蔗糖
                                                            22020.6软件，利用Beta多样性分析法 分析各组小鼠盲
                                                                                            [25]
        水溶液和水，喂养24 h后，测定此时糖水偏好百分比[糖
                                                            肠内容物中肠道微生物多样性是否存在差异；在每组小
        水偏好百分比＝蔗糖水溶液消耗量/（蔗糖水溶液消耗
                                                            鼠盲肠内容物样品经OTU聚类后的每个OTU中选取代
        量+水消耗量）×100％]。
                                                            表序列与微生物参考数据库              [26－30] 进行比对，得到每个
        2.4  旷场行为学实验
                                                            OTU对应的物种分类信息，并找出各组样品中的共有微
            参考文献[22]，于糖水偏好实验后，将各组小鼠在实
                                                            生物，进而在门（Phylum）、属（Genus）水平上统计各样品
        验环境中放置 10 min，然后放置在旷场仪的中间，记录
                                                            微生物群落组成。利用QIIME 22020.6软件生成不同水
        小鼠5 min内穿过旷场中心区域次数。
                                                            平上的物种丰度表，进行物种多样性分析（为使效果更
        2.5  最小疼痛阈值的检测
                                                            好，笔者只选取相对丰度水平排前10位的物种，并将其
            旷场行为学实验后，各组小鼠禁食、禁水24 h，然后
        采用乙醚麻醉，再将涂有石蜡油且带气囊的 6 F 导尿管                         它物种合并为“others”进行展示）。
                                                            2.8 统计学方法
        （导尿管连接1 mL注射器用于向气囊内注水）经肛门插
        入，使气囊末端距离肛门 1 cm，并将其固定在小鼠的尾                             采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
        根部。然后将小鼠放入自制的透明塑料桶笼内（20 cm×                         料以 x±s 表示；组间两两比较，采用单因素方差分析。
        6 cm×6 cm），以限制小鼠只能前后运动不能转身。待小                       P＜0.05表示差异有统计学意义。
        鼠完全苏醒后先适应环境15 min，再记录引起小鼠疼痛                         3 结果
        的最小注水量，即最小疼痛阈值（以小鼠腹背部肌肉出                            3.1  参苓白术散对伴焦虑 IBS-D 模型小鼠腹泻情况和
        现强烈收缩或腹部抬离地面作为其最小疼痛阈值表                              体质量的影响
        现 ），以评价其内脏敏感性（最小疼痛阈值越大，敏感                               与空白对照组比较，模型组小鼠体质量显著降低
          [23]
        性越强）。各组小鼠重复测定 3 次，每次持续 30 s，间隔                     （P＜0.05），稀便率及腹泻指数显著升高（P＜0.05）；与模
        5 min。                                              型组比较，参苓白术散组小鼠体质量显著升高（P＜


        ·316 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 3                                    中国药房    2021年第32卷第3期
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