Page 61 - 《中国药房》2021年3期
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理）。自实验第29天开始，各药物组大鼠灌胃相应药物，                         夜；用 TBST 溶液缓慢清洗 5 min×3 次，分别加入二抗
        空白对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水；给药体                           （稀释度为 1 ∶ 10 000），于室温下孵育 2 h；用 TBST 溶液
        积均为10 mL/kg，每日1次，连续28 d。                           缓慢清洗5 min×3次，经ECL显影液显影后，置于化学发
        2.2 肺功能检测                                          光凝胶成像仪下成像。使用 Image J v1.8.0 软件进行分
            参照文献[9－10]，于末次给药后，腹腔注射 10％水                    析，以目标蛋白与内参（β-actin）条带的灰度值比值表示
        合氯醛溶液（3 mL/kg）对大鼠进行麻醉，将其以仰卧位                       目标蛋白的相对表达量。
        固定，切开颈部皮肤、肌肉后暴露气管，朝心方向剪一小                          2.5 统计学方法
        口，行气管插管约 2 cm，结扎固定。气管插管另一端与                            采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资
        动物肺功能分析系统连接，检测大鼠的用力肺活量                             料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
       （FVC）和第0.3秒用力呼气容积（FEV0.3 ），并以两者比值                   两两比较采用 LSD 法（方差齐）或 Games-Howell 法（方
       （FEV0.3/FVC）作为评价大鼠肺功能的指标。                           差不齐）。P＜0.05为差异有统计学意义。
        2.3 标本制备                                           3 结果
            肺功能检测结束后，在大鼠处于麻醉状态下于其腹                         3.1 清肺保元胶囊对模型大鼠肺功能的影响
        主动脉取血后，切开胸部，结扎右肺门，于颈部气管下端                              因造模损伤，除空白对照组外，其余各组均有动物
        作一 T 形切口，行气管插管，以磷酸盐缓冲液（PBS，pH                      死亡，其中模型组、地塞米松组和清肺保元胶囊高、中、
        7.4）进行肺泡灌洗。收集支气管肺泡灌洗液，以 2 000                      低剂量组分别死亡3、2、1、1、2只，药物组动物死亡较模
        r/min 离心 10 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中保存，                 型组少。
        用于IL-1β含量、白细胞计数的检测。处死大鼠，取右肺                            与空白对照组比较，模型组大鼠FEV0.3/FVC显著降
        组织适量，立即置于液氮中冷冻，随后转移至－80 ℃冰                         低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠 FEV0.3/FVC
        箱中保存，用于NLRP3通路相关蛋白表达的检测；取左                         均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），详见表1。
        肺组织适量，于4％多聚甲醛溶液中固定，用于肺组织形                            表1 清肺保元胶囊对模型大鼠肺功能的影响（x±±s）
        态学观察。                                              Tab 1   Effects of Qingfei baoyuan capsule on lung
        2.4  指标检测                                                  function in model rats（x±±s）
        2.4.1  肺组织病理观察         采用 HE 染色法。取“2.3”项           组别              剂量，mg/kg     n       FEV0.3/FVC，％
        下固定于 4％多聚甲醛溶液中的大鼠左肺组织适量，经                          空白对照组                        10        93.75±5.68
                                                           模型组                          7         85.46±4.89 ＊＊
        常规乙醇梯度洗脱、石蜡包埋后，切片（厚度约5 μm），再
                                                           地塞米松组              0.2       8         93.92±6.39 ##
        经HE染色后，于显微镜下观察大鼠肺组织病理改变。                           清肺保元胶囊高剂量组       1 232.0     9         92.48±6.11 #
        2.4.2  支气管肺泡灌洗液中 IL-1β含量             采用 ELISA      清肺保元胶囊中剂量组        616.0      9         95.19±7.19 ##
                                                           清肺保元胶囊低剂量组        308.0      8         90.12±4.63 #
        法。取“2.3”项下大鼠支气管肺泡灌洗液适量，使用全功
                                                                                                        ##
                                                                               ＊＊
                                                                                                 #
                                                               注：与空白对照组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜
        能酶标仪检测其中 IL-1β的含量，严格按照相应试剂盒
                                                           0.01
        说明书方法操作。                                               Note：vs. blank control group， ＊ ＊ P＜0.01；vs. model group，P＜
                                                                                                        #
        2.4.3  支气管肺泡灌洗液中白细胞计数                采用吉姆萨         0.05，P＜0.01
                                                               ##
        染色法检测。取“2.3”项下支气管肺泡灌洗液 10 μL，涂                     3.2  清肺保元胶囊对模型大鼠肺组织病理改变的影响
        抹于玻片上，晾干后滴加少量甲醇固定，将玻片置于吉                               空白对照组大鼠肺泡腔内未见炎性渗出物，肺泡腔
        姆萨染色液中浸染，用水冲洗后自然干燥，于显微镜下                           结构正常、无病理性扩大；模型组大鼠肺泡壁增厚、过度
        观察被染成紫色或蓝紫色的白细胞并计数，严格按照相                           膨胀，肺泡数目减少，可见大量炎性细胞浸润，部分可见
        应试剂盒说明书方法操作。                                       肺泡融合；地塞米松组和清肺保元胶囊高、中剂量组大
        2.4.4  肺组织中 NLRP3、Cleaved caspase-1 蛋白的表达          鼠肺泡结构基本恢复正常；清肺保元胶囊低剂量组大鼠
        情况    采用 Western blotting 法检测。取“2.3”项下大鼠           肺组织可见少量炎性细胞浸润，详见图1。
        右肺组织适量，置于 EP 管内，于冰上捣碎后匀浆，以                         3.3  清肺保元胶囊对模型大鼠支气管肺泡灌洗液中
        13 000 r/min 离心 5 min，取上清液，采用 BCA 法测定蛋             IL-1β含量和白细胞计数的影响
        白含量后，煮沸变性。取变性蛋白适量，行 SDS-PAGE                           与空白对照组比较，模型组大鼠支气管肺泡灌洗液
        分离并转移至 PVDF 膜上，在室温下以 5％脱脂奶粉封                       中 IL-1β含量和白细胞计数均显著升高（P＜0.01）；与模
        闭1 h，分别加入NLRP3、Cleaved Caspase-1、β-actin一抗         型组比较，各给药组大鼠支气管肺泡灌洗液中上述指标
       （稀释度分别为 1 ∶ 300、1 ∶ 2 500、1 ∶ 6 000），4 ℃孵育过         均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见表2。



        中国药房    2021年第32卷第3期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 3  ·311 ·
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