Page 53 - 《中国药房》2021年3期
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恒温培养箱、Multiskan FC型酶标仪、Megafuge 8型离心               链霉素的 DMEM 高糖完全培养基（以下简称“培养
        机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），AE31 型倒置相        基”），于37 ℃、5％ CO2条件下培养，每隔2 d进行传代，
        差显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），S11 型电热恒                        取对数生长期细胞进行试验。
        温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）。                                2.2 脑心通胶囊各药效成分对细胞增殖的影响
        1.2 主要药品与试剂                                            采用CCK-8法进行检测。将HUVEC按3 000个/孔
            本研究所用的主要药品与试剂有：咖啡酸、阿魏                          接种于96孔板中，待细胞贴壁后，吸弃培养基，备用。将
        酸、洋川芎内酯 H、丁烯基苯酞、藁本内酯对照品（南京                         细胞分为空白对照组（溶剂为含或不含 0.1％DMSO 的
        良 纬 生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为 lw16081501、         培养基）和脑心通胶囊药效成分不同浓度组[每个药效
        lw170112004、lw18010302、lw16042702、lw18010501，纯     成分均设置8个终浓度（各浓度设置参考预试验结果，详
        度均不低于 98％），隐丹参酮、丹参素钠、芍药苷、芒柄花                       见表2），按相应对照品溶解性采用含或不含0.1％DMSO
        素、丹酚酸B、儿茶素、黄芪甲苷对照品（成都克洛玛生物                         的 培 养 基 配 成]。 空 白 对 照 组 加 入 含 或 不 含 0.1％
        科技有限公司，批号分别为 CHB190305、CHB180108、                  DMSO的培养基200 μL，脑心通胶囊药效成分不同浓度
        CHB190124、CHB180130、CHB180108、CHB180809、           组加入相应药液 200 μL，每组设 6 个复孔，于 37 ℃、5％
        CHB190107，纯度均不低于98％），磷酸盐缓冲液（PBS，                   CO2条件下培养 24 h。吸弃培养基后，每孔加入 CCK-8
        博斯特生物技术有限公司，批号PYGOO21），二甲基亚砜                       溶液60 μL，继续培养1 h后，使用酶标仪于450 nm波长
       （DMSO）、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司，批                        处检测各孔光密度（OD）值，并计算细胞存活率（细胞存
        号分别为1213C0330、20190320），胎牛血清、胰酶、DMEM               活率＝OD 药效成分组/OD 空白对照×100％）。
        高 糖 完 全 培 养 基（美 国 HyClone 公 司 ，批 号 分 别 为            表2 脑心通胶囊药效成分不同浓度组终浓度设置情况
        NYMI1035、J170003、AL209346），CCK-8试剂[东仁化学科           Tab 2  The final concentration setting of different con-
        技（上海）有限公司，批号NG703]，PAI-1、ICAM-1、VEGF                      centration groups of the active components in
        酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海茁彩生物科技有                              Naoxintong capsules
        限公司，批号分别为0711E19、0711E19、0711E19），NF-κB            组别          溶剂            浓度梯度（记为浓度1～8）
                                                           咖啡酸组        培养基           1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
        p65、VCAM-1 ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股                    阿魏酸组        培养基           1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL
        份有限公司，批号分别为W5Z6C3RW4T、1BRVZE5H94），                 洋川芎内酯H组     含0.1％DMSO的培养基  3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L
                                                           丁烯基苯酞组      含0.1％DMSO的培养基  3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L
        RNA 快速提取试剂盒、逆转录试剂盒、反转录 PCR
                                                           藁本内酯组       含0.1％DMSO的培养基  1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
       （RT-PCR）扩增试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司，批                        隐丹参酮组       含0.1％DMSO的培养基  0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L
        号分别为20190901、20190901、20190901），PCR引物（华            丹参素钠组       培养基           1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
                                                           芍药苷组        含0.1％DMSO的培养基  1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
        大基因公司设计合成，引物序列及产物长度见表1）。                           芒柄花素组       含0.1％DMSO的培养基  1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
                  表 1  PCR引物序列及引物长度                        丹酚酸B组       培养基           1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
                                                           儿茶素组        含0.1％DMSO的培养基  1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
            Tab 1 Sequence and length of PCR primers
                                                           黄芪甲苷组       含0.1％DMSO的培养基  1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L
        基因                  引物序列                 产物长度，bp   2.3  脑心通胶囊各药效成分对细胞中 JAK/STAT 信号
        JAK2       上游5′-GTGTTCCATTTGATAGAACTTTTGAAGA-3′  28
                   下游5′-ATTATTGTTCCAGCATTCTGTCATGA-3′  26  通路相关蛋白mRNA表达的影响考察
        STAT3      上游5′-CATCATGGGCTTTATCAGTAAGGA-3′  24        采用RT-PCR法进行测定。将HUVEC按1×10 个/孔
                                                                                                      5
                   下游5′-GTCAATGGTATTGCTGCAGGTCGT-3′  24
        Akt        上游5′-GTATGCTGGCAGAGTAGGAGAAC-3′  23     接种于6孔板内，待细胞贴壁后，吸弃培养基，备用。将
                   下游5′-CAGGTAACATCAGAGACAGACACA-3′  24    细胞分为空白对照组和脑心通胶囊药效成分不同浓度
        ERK        上游5′-CGCCCCTCCAAACGGCTCAA-3′    20      组（各药效成分终浓度根据“2.2”项下筛选结果制定，按
                   下游5′-GCAGCGCCTCCCTTGCTAGA-3′    20
        GAPDH      上游5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′    20      相应对照品溶解性采用含或不含0.1％ DMSO的培养基
                   下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′    20      配 成 相 应 药 液）。 空 白 对 照 组 加 入 含 或 不 含 0.1％
        1.3 细胞                                             DMSO的培养基4 mL，脑心通胶囊药效成分不同浓度组
            HUVEC由河南中医药大学第一附属医院中药药理                        加入含相应药液 4 mL，每组设 3 个复孔，于 37 ℃、5％
        实验室惠赠。                                             CO2条件下培养24 h。收集细胞并提取总RNA后，取适
        2 方法                                               量逆转录成 cDNA。以 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。
        2.1  细胞培养                                          PCR反应体系（20 μL）为：PCR扩增缓冲液10 μL、cDNA
            将 HUVEC 复苏后，接种到含 10％胎牛血清、1％青                   1 μL、上下游引物各 0.04 μL 和适量双蒸水。反应条件


        中国药房    2021年第32卷第3期                                               China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 3  ·303 ·
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