Page 46 - 《中国药房》2021年3期

表1 怀牛膝饮片来源信息 mL 氯仿溶液进行萃取，弃去氯仿层，取上层溶液；再如
Tab 1 Source information of A. bidentata 上重复操作3次，合并上层溶液后以0.35 µm滤膜滤过，
编号 品名 产地 规格 批号 生产厂家 即得到经衍生化处理后的各溶液。分别吸取经衍生化
S1 怀牛膝 河南博爱县 头肥 190712 先声再康江苏药业有限公司 处理后的各单糖对照品溶液 0.2 mL，充分混合后，经
S2 怀牛膝 河南沁阳县 段 190724 浙江景岳堂药业有限公司
S3 怀牛膝 河南武陟县 统段 190701 安徽佳凯药业股份有限公司 0.35 µm滤膜过滤，收集滤液，即得经衍生化处理后的混
S4 怀牛膝 河南武陟县 统段 190501 安徽佳凯药业股份有限公司 合对照品溶液。
S5 怀牛膝 河南武陟县 统段 190712 亳州市永刚饮片厂有限公司 2.4 色谱条件与系统适用性试验
S6 怀牛膝 河南焦作县 统 190119 河北金草药业有限公司
S7 怀牛膝 河南温县 段 190123 安徽省六安市绿丰中药材有限公司 色谱柱为 Hanbon Hedera C18 （250 mm×4.6 mm，5
S8 怀牛膝 河南沁阳县 段 191112 六品叶商贸有限公司 μm）；以乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸铵溶液（B）为流动相进
S9 怀牛膝 河南博爱县 统段 191115 桦甸市栢晟商贸有限公司
S10 怀牛膝 河南温县 统段 191101 吉林省品茸堂商贸有限公司 行梯度洗脱（0～15 min，19％A；15～50 min，19％A→
35％A；50～55 min，35％A→42％A；55～55.1 min，42％
筛，并以 80％乙醇为溶剂[料液比 1 ∶ 12（g/mL）]在 80 ℃
A→19％A；55.1～60 min，19％A）；柱温为30 ℃；流速为
水浴中回流提取2次，每次2 h；弃去滤液，滤渣挥干溶剂
1.2 mL/min；检测波长为250 nm；进样量为20 μL。取按
后称质量，然后继续以水为溶剂[料液比1 ∶ 15（g/mL）]在
“2.3”方法衍生化处理的怀牛膝多糖水解液（样品编号
98 ℃水浴中回流提取3次，每次2 h；合并3次水提取液，
S6）、阴性对照溶液和混合对照品溶液，分别在此色谱条
抽滤，合并滤液后浓缩至50 mL，冷却。缓慢向浓缩液中
件下进样测定，记录色谱图。结果，在此色谱条件下，各
加入无水乙醇至乙醇终体积分数为 70％，室温静置 24
成分峰均能达到良好分离（分离度均大于 1.5），理论板
h，抽滤后得沉淀物1；然后将滤液浓缩至50 mL，再次加
数以甘露糖计大于 6 000，且阴性对照溶液对样品峰的
入无水乙醇至乙醇终体积分数为 80％，室温下静置 24
测定不产生干扰。各溶液的衍生化-HPLC图谱见图1。
h，抽滤得沉淀物2。合并沉淀物1和沉淀物2，用丙酮和
无水乙醇交替洗涤，直至洗液变为无色为止，然后干燥 1 100
1 000
除去残留的洗涤试剂后，得到的沉淀物即为怀牛膝多 900
800
[15]
糖。以 D-无水葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法 测 700
mV 600
得 10 批怀牛膝饮片（编号 S1～S10）中多糖的得率分别 U， 500
400
为18.10％、18.30％、17.56％、10.74％、17.52％、16.08％、 300
200
15.88％、13.2％、14.8％、16.52％。 100
0
2.2 溶液的制备 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
t，min
2.2.1 单糖对照品溶液 称取 D-无水葡萄糖对照品 A.混合对照品溶液
6.87 mg、D-甘露糖对照品 5.51 mg、鼠李糖对照品 5.70 800
700
mg、D-半乳糖醛酸对照品 4.66 mg、L（+）阿拉伯糖对照
600
品4.35 mg，置于不同1 mL量瓶中，分别用水溶解并稀释 500
mV 400
至刻度，涡旋混匀，即得各单糖的单一对照品溶液。 U， 300
2.2.2 怀牛膝多糖水解液 精密称取 100 mg 怀牛膝多 200
100
糖至 10 mL 离心管中，加入 2 mol/L 三氟乙酸溶液 4 mL 0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60
使溶解，密封后，在110 ℃烘箱中水解4 h；取出，冷却至 t，min
常温，并以 3 mol/L NaOH 溶液调节水解液的 pH 至 6.5， B.怀牛膝多糖水解液（样品编号S6）
160
即得。 140
2.2.3 阴性对照溶液 除不加多糖样品外，其余按 120
100
“2.2.2”项下方法操作，制得阴性对照溶液。 mV U， 80
2.3 衍生化处理及各衍生化溶液制备 60
40
精密吸取“2.2.1”项下各单糖对照品溶液、“2.2.2”项 20
0
下多糖水解液和“2.2.3”项下阴性对照溶液各0.3 mL，置 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60
t，min
于不同 5 mL 离心管中，分别加入 0.5 mol/L PMP 甲醇溶 C.阴性对照溶液
液 300 µL 和 0.3 mol/L NaOH 溶液 300 µL，涡旋混合，在 图1 各溶液的衍生化-HPLC图谱
70 ℃水浴中衍生 30 min；待衍生完毕放冷后，加入 0.3 Fig 1 Derivatization-HPLC chromatograms of each
mol/L HCl 溶液 300 µL 终止反应。在离心管中加入 1 solution

·296 · China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 3 中国药房 2021年第32卷第3期