Page 30 - 《中国药房》2021年3期
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1.3 动物                                              K2CO3溶液调节组织上清液的pH至中性，再次在4 ℃下
            SPF 级健康 SD 大鼠 50 只，雄性，体质量 230～280               以12 000 r/min离心5 min，以0.22 µm微孔滤膜过滤，取
        g，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供[动物使                           滤液，然后按文献[15]色谱条件进样分析。
        用合格证号为SYXK（新）2016-0001]。所有大鼠均自由                     2.5  大鼠心肌组织中AMPK、SIRT1和PGC-1α mRNA
        摄食、饮水，并分笼饲养于温度为 22～25 ℃、相对湿度                        表达水平测定
        为 40％～60％的环境中，适应性饲养 1 周后用于实验。                           采用实时荧光定量-PCR 法测定大鼠心肌组织中
        本研究实验过程满足动物实验“3R”原则。                                AMPK、SIRT 1 和 PGC-1α mRNA 表达水平。取大鼠心
        2 方法                                                肌组织适量，使用组织总 RNA 抽提试剂盒提取其总
        2.1 分组与给药                                           RNA，验证其纯度后，按 cDNA 逆转录试剂盒方法合成
            将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、TFDM                       cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系（共
        组、Compound C+TFDM组和EX-527+TFDM组，每组10                20 μL）包括 2×QuantiNova SYBR Green PCR Master mix
        只。假手术组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水；                              10 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 6
        TFDM 组大鼠灌胃 60 mg/（kg·d）TFDM（以提取物计，                  μL。PCR 反应条件为 95 ℃预变性 1 min；95 ℃ 变性 10
        下同）   [8，12] ；Compound C+TFDM 组大鼠灌胃 TFDM 60         s，60 ℃退火/延伸 15 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内
        mg/（kg·d），并于再灌注前 15 min 尾静脉注射 250 μg/kg             参，采用2   －ΔΔCt 法计算各目的基因的表达水平。引物序列
                   [13]
        Compound C ；EX-527+TFDM 组大鼠灌胃 TFDM 60               及扩增产物长度见表1。
        mg/（kg·d），并于再灌注前 20 min 腹腔注射 5 mg/kg                          表1 引物序列及扩增产物长度
        EX-527 。药物均使用生理盐水溶解，灌胃体积均为                          Tab 1  PCR primer sequence and amplification pro-
               [14]
        2.5 mL/kg，每天灌胃给药1次，连续7 d。给药结束后，除                           duct length
        假手术组外的其余4组大鼠均建立MIRI模型。                              基因名称               引物序列                扩增产物长度，bp
        2.2  大鼠MIRI模型的建立及取材                                 AMPK       上游：5′-TTGCGTGTGCGAAGGAAGAACC-3′  158
                                                                       下游：5′-CCGATCTCTGTGGAGTAGCAGTCC-3′
            腹腔注射 25％乌拉坦（5 mL/kg）将大鼠麻醉后，将                    SIRT1      上游：5′-GCTCGCCTTGCTGTGGACTTC-3′  147
        其仰位固定，进行气管插管；沿胸骨左缘 3～4 肋间开胸                                    下游：5′-GTGACACAGAGATGGCTGGAACTG-3′
                                                            PGC-1α     上游：5′-CGGTGGATGAAGACGGATTGCC-3′  180
        后，立刻连接呼吸机（呼吸频率 60 次/min，潮气量 60
                                                                       下游：5′-ATTGTAGCTGAGCTGAGTGTTGGC-3′
        mL/kg，呼吸比3 ∶ 2），暴露心脏，迅速结扎左冠状动脉前                     GAPDH      上游：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′  126
        降支，结扎完成后立刻让心脏回位；缺血30 min后，剪断                                   下游：5′-CAGCATACTCAGCACCAGCATCAC-3′
        结扎线，再灌注 120 min 。再灌注结束后，迅速剪取心                       2.6  大鼠心肌组织中AMPK蛋白磷酸化水平及SITR1
                             [9]
        脏，置于冰生理盐水中，轻柔洗去心腔内血液，将整颗心                           和PGC-1α 蛋白表达水平检测
        脏置于－80 ℃冰箱中冻存，待测。假手术组大鼠进行同                              采 用 Western blotting 法 检 测 大 鼠 心 肌 组 织 中
        样实验操作，但不结扎左冠状动脉前降支。                                 AMPK 蛋白的磷酸化水平及 SITR 1、PGC-1α蛋白表达
        2.3  大鼠心肌组织病理学形态观察                                  水平。取大鼠心肌组织 80 mg，用含有蛋白酶抑制剂和
            采用苏木精-伊红（HE）染色法观察大鼠心肌组织病                        磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取其总蛋白，采用 BCA
        理学形态变化。取大鼠心脏心尖及左心室壁进行常规                             法测定蛋白浓度。蛋白经变性处理（99 ℃，10 min）后，
        石蜡包埋、切片（厚度为5 μm）。将组织切片经二甲苯及                         取 50 μg 在 80 V 电压下经 10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯
        梯度乙醇脱蜡后，以苏木精染色 3 min，再以 1％盐酸乙                       酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离 90 min，湿法转膜（200
        醇分化30 s，然后以0.5％伊红染色3 min，接着依次经梯                     mA，120 min）至PVDF 膜上；将膜用5％脱脂奶粉封闭1
        度乙醇和二甲苯进行脱水透明，于通风橱中晾干后，用                            h，然后分别加入 AMPK 一抗（稀释比例为 1 ∶ 500）、
        中性树胶封片，显微镜下拍照并观察大鼠心肌组织的病                            p-AMPK 一抗（稀释比例为 1：1 000）、SIRT1 一抗（稀释
        理学形态变化。                                             比例为 1 ∶ 1 000）、PGC-1α一抗（稀释比例为 1 ∶ 1 000）、
                                                +
        2.4 大鼠心肌组织中ATP、ADP、AMP和NAD 含量测定                     GAPDH 一抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000），4 °C 孵育过夜；以
            按照前期建立的反相HPLC法测定大鼠心肌组织中                         TBST缓冲液洗膜10 min×3次，然后加入相应二抗（稀释
        ATP、ADP、AMP、NAD+的含量 。取大鼠心肌组织适                       比例均为1 ∶ 20 000），室温孵育1 h；以TBST缓冲液洗膜
                                    [15]
        量，迅速称质量，冰浴下按3 mL/kg的量分次加入预冷的                        10 min×3 次，采用 ECL 化学发光液显影后，经凝胶成像
        0.5 mol/L HClO4溶液，低温下制备组织匀浆，再于冰上                    系统成像。采用Image J 1.6.0软件对蛋白条带进行灰度值
        静置5 min，使蛋白充分沉淀。然后将组织匀浆液在4 ℃                        分析，以p-AMPK与AMPK条带灰度值的比值表示AMPK
        下以 12 000 r/min 离心 5 min，取上清，再用 2.5 mol/L           蛋白的磷酸化水平，以其余目标蛋白与内参 GAPDH 条


        ·280 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 3                                    中国药房    2021年第32卷第3期
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