Page 56 - 《中国药房》2021年2期
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2 方法与结果                                             取续滤液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。
        2.1 甘草饮片DPPH清除率的检测                                  2.2.2 DPPH甲醇溶液的制备          按“2.1.2”项下方法制备
        2.1.1  供试品溶液的制备          取甘草饮片（编号 S6），粉             浓度为80 μmol/L的DPPH甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中保
        碎，过 60 目筛，取约 0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶                    存，备用。
        中，精密加入甲醇 25 mL，密塞，称定质量，超声（功率                        2.2.3 HPLC-UV-DPPH 的 色 谱 条 件          以 Agilent
        250 W，频率 40 kHz，下同）处理 30 min，放冷，再次称定                Eclipse XDB-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱；以乙
        质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，经 0.45 μm 微孔滤                      腈（A）-0.2％甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10
        膜滤过，取续滤液，即得。                                        min，15％A→25％ A；10～20.3 min，25％ A→30％ A；
        2.1.2 DPPH 甲醇溶液的制备           取 DPPH 标准品适量，          20.3～70 min，30％ A→70％ A；70～75 min，70％ A→
        精密称定，加甲醇制成浓度为0.266 3 μmol/mL的DPPH                   15％A）；检测波长为 254 nm；柱温为 30 ℃；流速为 0.8
        甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。                                 mL/min；进样量为 10 μL。柱后自由基分析系统的流动
        2.1.3  半数抑制浓度（IC50 ）的测定         取“2.1.1”项下供试        相为 80 μmol/L DPPH 甲醇溶液；流速为 0.8 mL/min；检
        品溶液适量，加甲醇稀释，制成质量浓度分别为 10.00、                        测波长为517 nm；柱后温度为30 ℃。
        2.00、1.00、0.80、0.40、0.20、0.10、0.04 mg/mL（以生药量       2.2.4 HPLC-TOF/MS 的色谱与质谱条件             以 Agilent
        计）的样品溶液。分别取上述不同质量浓度的样品溶液                            Eclipse XDB-C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱；以乙
        2 mL，置于 EP 管中，加入“2.1.2”项下 DPPH 甲醇溶液 2               腈（A）-0.2％甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～10
        mL，摇匀，置于暗处反应 30 min，使用酶标仪于 517 nm                   min，15％ A→25％ A；10～20.3 min，25％ A→30％ A；
        波长处测定样品溶液与 DPPH 甲醇溶液混合液的吸光                          20.3～70 min，30％ A→70％ A；70～75 min，70％A→
        度（Ai ）；同时，测定空白对照溶液（甲醇）的吸光度（A0 ）、                    15％A）；检测波长为 254 nm；柱温为 30 ℃；流速为 0.8
        样品溶液与甲醇混合液（等体积混合，于暗处反应 30                           mL/min；进样量为 2 μL。质谱条件为三通分流至 0.27
        min）的吸光度（Aj ），每样品重复测定 3 次，求平均值，计                    mL/min；离子源为电喷雾离子源；离子模式为正离子模
        算 DPPH 清 除 率 和 IC50。 DPPH 清 除 率（％）＝（1 －             式；全扫描范围为 m/z 100～1 000；毛细管电压为 4 000
                                                            V；干燥气体积流量为8 L/min；温度为350 ℃；裂解电压
         Ai－Aj        [19]
               ）×100％ 。结果，上述各质量浓度供试品溶液
           A0                                               为300 V；锥孔电压为65 V；雾化气压力为30 psi。
        的 DPPH 清 除 率 分 别 为 98.38％ 、74.36％ 、62.55％ 、         2.2.5  数据分析      采用 Qualitive Analyst B 06.00 Build
        51.71％、50.95％、45.07％、44.88％、44.74％，IC50为 0.24       6.0.633.0软件对HPLC-TOF/MS所得数据进行分析。通
        mg/mL。                                              过对比分析甘草的紫外吸收光谱、在线图谱、质谱信息
        2.1.4  甘草饮片 DPPH 清除率的检测             按“2.1.3”项下      及各化合物的保留时间、精确分子量，同时参考相关文
        IC50结果，分别称取8批甘草饮片粉末，约0.25 g，精密称                     献 [20－25] ，对可能存在抗氧化活性的成分进行鉴定。
        定，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，精密量取 0.6                      2.2.6  抗氧化活性成分的检测与鉴定结果                 取“2.2.1”
        mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，按“2.1.3”项下方法                    项下供试品溶液适量，按“2.2.3”“2.2.4”项下条件进样分
        测定吸光度并计算DPPH清除率，结果见表2。由表2可                          析，记录色谱图。结果，甘草饮片在线鉴别出7种抗氧化
        知，8 批甘草饮片的 DPPH 清除率为 55.71％～60.17％，                 活性成分，经鉴定分别为阿佛洛莫生、8-异戊烯基柚皮
        其中S8样品的DPPH清除率最高，S7样品最低。                            素、黄羽扇豆魏特酮、半甘草异黄酮 B、3′，4′-二甲氧
                 表2 甘草饮片的DPPH清除率结果                          基-3-羟基-6-甲基黄酮、甘草宁 E、甘草宁 H。甘草饮片
        Tab 2 DPPH free radical scavenging rate of G. uralen-  的高效液相色谱图见图 1（图中，峰 1～7 分别对应上述
               sis decoction pieces                         化合物，后图同），DPPH自由基在线图谱见图2，甘草饮

        编号           清除率，％        编号        清除率，％           片的总离子流图见图 3，甘草饮片质谱图所对应的色谱
        S1            56.47       S5          58.83         图见图 4，其抗氧化活性成分的结构式见图 5，其质谱鉴
        S2            57.40       S6          58.32
        S3            59.88       S7          55.71         定结果见表3。
        S4            58.13       S8          60.17         2.3 裂解规律及特征分析
        2.2 甘草抗氧化活性成分的筛选与鉴定                                     化合物 1：保留时间为 49.542 min（以图 4 为例，下
        2.2.1  供试品溶液的制备          取甘草饮片粉碎，过 60 目             同），在正离子模式下出现准分子离子峰 m/z 299.092 6
                                                                  +
        筛，取约 0.75 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇                       [M+H] ，推断可能的分子式为 C17H14O5。进一步进行碎
        15 mL，密塞，超声处理 30 min，放冷，再次称定质量，用                    片扫描，发现主要碎片m/z 284.332 2，推测可能为准分子
        甲醇补足减失的质量，摇匀，经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，                      离子脱掉 1 分子 CH3 所得；同时，还存在 m/z 132.101 5


        ·178 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 2                                    中国药房    2021年第32卷第2期
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