Page 104 - 《中国药房》2021年2期
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mmol/L FeSO4 ·7H2O 溶液各 1 mL，再加入 0.75 mmol/L 2.3.2 培养液和造模液的配制 （1）含 0.2％胎牛血清
邻二氮菲溶液和 0.01％H2O2溶液各 1 mL，于 37 ℃保温 的 RPMI-1640 培养液：将胎牛血清 1 mL 和青霉素-链霉
1 h，取出，使用紫外-可见分光光度计在 536 nm 波长处 素双抗溶液 5.6 mL 加入至 RPMI-1640 培养液 500 mL
检测吸光度（An′）；另以水替代 H2O2溶液同法检测吸光 中，即得含0.2％胎牛血清和1％双抗的RPMI-1640培养
度（An ），以水替代样品溶液同法检测吸光度（A0′），以水 液。（2）含 10％胎牛血清的 RPMI-1640 培养液：将胎牛
替代样品溶液和 H2O2溶液同法检测吸光度（A0 ）。以 Vc 血清 55 mL 和青霉素-链霉素双抗溶液 5.6 mL 加入至
作为阳性对照，每个样品重复检测3次，取平均值，计算 RPMI-1640 培养液 500 mL 中，即得含 10％胎牛血清和
羟基自由基清除率：羟基自由基清除率（％）＝[1－（An－ 1％双抗的 RPMI-1640 培养液。（3）10％医用脂肪乳造
An′）/（A0－A0′）]×100％。以清除率（y，％）为纵坐标、质 模液：将医用脂肪乳 10 mL 加入至含 10％胎牛血清的
量浓度（x，mg/mL）为横坐标进行回归分析，计算半数抑 RPMI-1640培养液90 mL中，即得。
制浓度（IC50 ）。 2.3.3 脂肪变性 L02 肝细胞模型的建立 参考文献方
[15]
2.2.3 对超氧阴离子自由基的清除能力的检测 参考 法 ，取对数生长期的 L02 肝细胞用 0.25％胰蛋白酶消
文献[13]方法，在10 mL具塞试管中，分别加入质量浓度 化，按5×10 个/孔接种于6孔板中，于37 ℃、5％CO2培养
5
分别为 0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL（Vc）或 箱及饱和湿度条件（培养条件下同）下培养，当细胞长至
0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL（乙酸乙酯萃取物、正丁 80％融合时，用含 0.2％胎牛血清的 RPMI-1640 培养液
醇萃取物）或 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL（乙醇提取 进行饥饿处理 24 h，使细胞周期同步化，随后每孔加入
物、石油醚萃取物）的样品溶液1 mL、0.1 mol/L Tris-HCl 10％医用脂肪乳造模液 2 mL，继续培养 24 h，以建立脂
缓冲液（pH 8.2）4.5 mL，在 25 ℃下恒温水浴 20 min，再 肪变性L02肝细胞模型。
加入 3 mol/L 的邻苯三酚溶液 0.5 mL，迅速混匀后于 2.3.4 分组、给药与处理 将细胞周期同步化后的细胞
37 ℃下保温 5 min，立即加入浓盐酸（8 mol/L）2 滴终止 分为正常对照组、模型组、非诺贝特组和提取物/萃取物
反应，使用紫外-可见光光度计在 425 nm 波长处检测吸 高、低浓度组，每组设3个复孔。除正常对照组细胞在含
光度（A1 ）；另以水替代邻苯三酚溶液同法检测吸光度 10％胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中培养 24 h 外，其
（A2 ），以水替代样品溶液同法检测吸光度（A0 ）。以Vc作 余各组细胞均按“2.3.3”项下方法建模。建模后，正常
为对照，每个样品重复检测3次，取平均值，计算超氧阴 对照组和模型组细胞分别加入含 10％胎牛血清的
离子自由基清除率：超氧阴离子自由基清除率（％）＝ RPMI-1640 培养液 2 mL，非诺贝特组和提取物/萃取物
[1－（A1－A2 ）/A0]×100％。按“2.2.2”项下方法计算IC50。 高、低浓度组细胞分别加入“2.3.1”项下供试品药液 2
2.2.4 对DPPH自由基的清除能力的检测 参考文献[14] mL。培养24 h后，用PBS清洗细胞2～3次，收集细胞并
方法，在 10 mL 具塞试管中，分别加入质量浓度分别为 置于1.5 mL离心管中，以2 000 r/min 离心 3 min，弃上清
0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL（Vc）或 液，沉淀加入 2％Triton X-100 试剂 30 μL，反复冻融 3
0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 mg/mL（乙醇提取物、石 次，待细胞充分裂解后，于 4 ℃下以 5 000 r/min离心10
油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物）的样品溶 min，取上清液，按生化法以酶标仪测定 TC 和 TG 的含
液和 0.125 mmol/L DPPH 溶液各 2 mL，混匀，于 37 ℃水 量，具体操作按试剂盒说明书操作。
浴中反应 30 min，使用紫外-可见光光度计在 517 nm 波 2.4 数据处理
长处检测吸光度（A1 ）；以无水乙醇替代 DPPH 溶液同法 统计图和回归分析采用 GraphPad Prism 5.0 软件处
检测吸光度（A2 ），以无水乙醇替代样品溶液同法检测吸 理，统计学分析使用SPSS 18.0软件完成。结果均以x±
光度（A0 ）。以 Vc 作为对照，每个样品重复检测 3 次，取 s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差
平均值，计算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率 异有统计学意义。
（％）＝[1－（A1－A2 ）/A0]×100％。按“2.2.2”项下方法计 3 结果
算IC50。 3.1 滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对
2.3 降脂试验 羟基自由基清除能力的影响
2.3.1 供试品药液的配制 分别精密称滇黄芩茎叶乙 滇黄芩茎叶乙醇提取物及其不同溶剂萃取部位对
醇提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物（根据抗氧化 羟基自由基均有不同程度的清除能力，其清除率有随质
活性结果选择样品，其中石油醚萃取物抗氧化活性欠 量浓度增加而升高的趋势。其中，滇黄芩茎叶乙醇提取
佳，故不进行降脂试验）各2.0 g，用二甲基亚砜（DMSO） 物和石油醚萃取物对羟基自由基的清除能力均弱于Vc，
溶解配制成质量浓度均为1 mg/mL的母液，再用RPMI- 而其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物对羟基自由基的
1640 培养液将其稀释成 100、50 μg/mL 的供试品药液。 清除能力均强于 Vc。各提取物/萃取物清除能力强弱
同法将非诺贝特（阳性对照）配制成质量浓度为20 μg/mL （即 IC50由小到大）排序为：正丁醇萃取物＞乙酸乙酯萃
的供试品药液。浓度按预试验结果设置。 取物＞Vc＞乙醇提取物＞石油醚萃取物。回归分析结
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