Page 60 - 《中国药房》2021年第1期

HCT116 细胞 48 h 后均能有效抑制其增殖活性，且具有
LC3Ⅰ 16 kDa
LC3Ⅱ 14 kDa 一定的浓度依赖性趋势。在此基础上，本课题组进一步
研究紫草素是否诱导HCT116细胞发生了经典的细胞Ⅰ
Beclin-1 52 kDa 型程序性死亡（凋亡）和Ⅱ型程序性死亡（自噬）。经
Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染流式细胞术检测后发现，HCT116
p62 62 kDa 细胞在紫草素的诱导下发生了凋亡，其中在高质量浓度
（40 μg/mL）紫草素的诱导下效果最为显著。
β-actin 43 kDa LC3 是哺乳动物中酵母 ATG8 的同源物，参与自噬
[20]
体的形成，常被作为细胞自噬的标志性因子 。本研究
空白对照组 紫草素低质量 紫草素中质量 紫草素高质量
浓度组 浓度组 浓度组 结果显示，紫草素作用 48 h 后，细胞中 LC3 mRNA 的表
图 2 各组细胞中 LC3、Beclin-1 和 p62 蛋白表达的电 达水平显著升高，提示自噬体形成增多。自噬的发生主
泳图 要受两条途径的调节：mTOR 途径和 Beclin-1 途径。其
Fig 2 Electrophoresis diagram of protein expression 中，Beclin-1 是哺乳类动物中第１个被确认参与自噬调
of LC3，Beclin-1 and p62 in cells of each group 节的特异性基因，主要通过和磷脂酰肌醇3-激酶（P13K）
表4 各组细胞中LC3、Beclin-1和p62蛋白表达水平测 形成复合体来参与自噬体的形成，在细胞的自噬和凋亡
定结果（x±±s，n＝3） 中发挥着重要作用 。本研究结果显示，紫草素作用48
[21]
Tab 4 Protein expression of LC3，Beclin-1 and p62 in h后，HCT116细胞中Beclin-1 mRNA的表达水平显著升
cells of each group（x±±s，n＝3） 高，提示HCT116细胞中的自噬途径受到调节，促进了自
组别 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ Beclin-1/β-actin p62/β-actin 噬体的形成。p62 是经典的自噬标志基因，是自噬活化
空白对照组 0.419 6±0.047 5 0.841 7±0.070 6 1.683 5±0.275 9 过程中的重要调节分子，在调控细胞的生长过程中发挥
紫草素低质量浓度组 0.505 9±0.046 5 ＊ 1.079 4±0.105 9 ＊ 0.969 6±0.146 6 ＊
[22]
紫草素中质量浓度组 0.776 0±0.105 9 ＊ 1.469 5±0.258 0 ＊ 0.557 9±0.073 6 ＊ 着重要作用，最终在自噬溶酶体中进行降解 。本研究
紫草素高质量浓度组 1.157 8±0.227 5 ＊＊ 1.775 1±0.276 1 ＊ 0.413 9±0.079 3 ＊＊ 结果显示，紫草素作用 48 h 后，HCT116 细胞中 p62
＊
＊＊
注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
mRNA的表达水平显著降低，这可能是由于LC3的生成
＊
Note：vs. blank control group，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
增多，导致了p62的降解加快所致。
自噬的异常存在密切关系：细胞凋亡是依赖于凋亡基因 LC3 蛋白存在 LC3Ⅰ与 LC3Ⅱ两种形式：当自噬发
及其编码的蛋白所调控的Ⅰ型程序性死亡，对维持细胞 生时，LC3蛋白C端被蛋白酶切割形成LC3Ⅰ，定位于细
内环境稳定和平衡具有重要作用；细胞自噬被称为Ⅱ型 胞质；LC3Ⅰ经泛素样加工修饰形成 LC3Ⅱ，定位于自噬
程序性细胞死亡，是依赖溶酶体降解细胞质内细胞器和 溶酶体膜上 [23-24] 。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值能更直观地反映自
大分子物质的代谢途径 [13-15] 。近年来研究证明，自噬可 噬活性，与自噬体形成的数量成正比 [23-24] 。为进一步明
作为肿瘤细胞的保护机制，在饥饿或药物刺激时肿瘤细 确紫草素是否激活 HCT116 细胞的自噬途径，本研究采
胞会迅速提高自身自噬水平，来提供自身所需要的营养 用 Western blotting 法在分子水平上证实了紫草素作用
物质和能量 [16-17] 。但是，过度的自噬也会抑制肿瘤细胞 48 h 后可显著升高 HCT116 细胞中 Beclin-1 蛋白表达水
生长，致使细胞发生自噬性死亡 [16-17] 。细胞凋亡与自噬 平和 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，显著降低 p62 蛋白表达水平。
[18]
功能的异常与结肠癌的发生发展也具有密切关系 。 该结果提示，紫草素可以有效激活 HCT116 细胞中的
手术加化疗是目前治疗结肠癌的常用方法，而恶性肿瘤 Beclin-1 自噬途径，这与伊曲康唑可通过激活人结肠癌
细胞对化疗药物产生耐受性是导致治疗进程受阻的主 细胞自噬而诱导凋亡的研究结果一致 。
[25]
要原因。由于中国传统中药具有多靶点、多成分的特 综上所述，紫草素可诱导人结肠癌细胞 HCT116 发
性，因此在恶性肿瘤治疗方面逐渐受到关注 。紫草素 生凋亡，并激活其自噬途径，提示紫草素可能是有效治
[19]
目前已显示出了多种抗肿瘤活性，可能是潜在的有效药 疗结肠癌的天然活性药物之一。但凋亡与自噬之间关
[9]
物 。 系复杂，有研究显示，自噬的启动可诱导细胞凋亡 。
[26]
本课题组前期首先通过初步的MTT试验进行抗肿 本研究也发现，紫草素在诱导 HCT116 细胞凋亡的同时
瘤活性筛选，计算出紫草素对 HCT116 细胞增殖的半数 也能诱导其发生自噬，但两者之间具体的相关机制还需
进一步研究。
抑制浓度（IC50 ）约为 20 μg/mL。故在本研究中采用 IC50
作为中质量浓度（20 μg/mL）、1/2的IC50作为低质量浓度 参考文献
（10 μg/mL）、2倍IC50作为高质量浓度（40 μg/mL）进行研 [ 1 ] ZHOU P，WANG C，HU Z，et al. Genistein induces apop-
究 。 结 果 发 现 ，低 、中 、高 质 量 浓 度 紫 草 素 作 用 于 tosis of colon cancer cells by reversal of epithelial-to-

·54 · China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 1 中国药房 2021年第32卷第1期