Page 58 - 《中国药房》2021年第1期
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素抗结肠癌的作用机制，从而为该药的开发及结肠癌的                            释为10、20、40 μg/mL的样品溶液。
        临床治疗提供参考。                                           2.2 紫草素对HCT116细胞增殖的影响考察
        1 材料                                                    采用MTT法检测。取对数生长期的HCT116细胞，
        1.1 仪器                                              接种于 RPMI 1640 完全培养基中，调整细胞密度为 1×
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            HF90 型 CO2 培养箱（上海力新仪器有限公司）；                     10 个/mL，将细胞接种至 96 孔板中，每孔 100 μL。将细
        M200 PRO 全波长全自动酶标仪（瑞士 Tecan 公司）；                    胞分为空白对照组（0 μg/mL）和紫草素低、中、高质量浓
        BDFACS Aria Ⅲ型流式细胞仪（美国 BD 公司）；Light                 度组（10、20、40 μg/mL），并设置不加细胞的阴性对照
        Cycler 96 型实时荧光定量-聚合酶链式反应（RT-qPCR）                  组，每组均设置 3 个复孔。每孔接种 100 μL 药液（各给
        仪（瑞士 Roche 公司）；INFINITY 3026 型凝胶成像系统                药组）或 RPMI 1640 培养基（空白对照组和阴性对照
        （法国Vilber Lourmat公司）；Pultton P200+型紫外分光光            组），每孔中 DMSO 的终浓度均为 1％。培养 48 h 后，每
        度计（北京五洲东方科技发展有限公司）。                                 孔中加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，将细胞置于
        1.2 药品与试剂                                           37 ℃、5％CO2培养箱中培养4 h；吸弃培养液，每孔中加
                                                            入 DMSO 溶液 100 μL，溶解沉淀，继续培养 10 min。采
            紫草素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：
                                                            用酶标仪检测各孔在 570 nm 波长处的光密度（OD）值，
        0769-9903，纯度：≥98.0％）；胎牛血清、二甲基亚砜
                                                            计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（％）＝[1－（阴
        （DMSO）、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；Trizol试剂（北京
                                                            性对照组OD值－加药组细胞OD值）/（阴性对照组细胞
        索莱宝科技有限公司）；MTT试剂（上海碧云天生物技术
                                                            OD 值－空白对照组细胞 OD 值）]×100％。试验重复
        有限公司）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染检测试剂盒（南京
                                                            3次。
        凯基生物技术有限公司，批号：KGA105-KGA108）；鼠抗
                                                            2.3  紫草素对HCT116细胞凋亡的影响考察
        人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、兔抗人微管相关蛋
                                                                采用流式细胞仪检测。取对数生长期 HCT116 细
        白轻链 3Ⅱ/Ⅰ（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）单克隆抗体、兔抗人自噬
                                                            胞，处理、接种、分组、给药方法均同“2.2”项下，每组均设
        相关蛋白 Beclin-1 单克隆抗体、兔抗人自噬相关蛋白
                                                            置3个复孔。培养48 h后，用胰酶消化并收集细胞，以磷
        p62 单克隆抗体（美国 CST 公司，批号：3700S、12741S、
                                                            酸盐缓冲液（PBS）漂洗后，将细胞重悬于Loading buffer
        3495S、23214S）；RPMI 1640 培养基、青-链霉素（美国
                                                            缓冲液中，分别加入 5 μL 的 Annexin Ⅴ-FITC 染色液和
        Hyclone公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠免
                                                            5 μL 的 PI 染色液，避光孵育 15 min，所有操作均在冰上
        疫球蛋白 G（IgG）二抗、HRP 标记的羊抗兔 IgG 二抗（成
                                                            进行。采用流式细胞仪在 1 h 内对染色细胞进行检测，
        都正能生物技术有限责任公司，批号：511103、511203）；
                                                            并用FlowJo V10软件测定细胞凋亡率。试验重复3次。
        Transcription Kit Quanti Nova 逆转录试剂盒（德国 Qia-
                                                            2.4  紫草素对HCT116细胞自噬相关基因mRNA 表达
        gen 公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（美
                                                            的影响考察
        国 Thermo Fisher Scientific 公司）；RIPA 蛋白裂解液（上
                                                                 采用 RT-qPCR 法检测。取对数生长期 HCT116 细
        海碧云天生物科技有限公司）；ECL 化学发光液（合肥
                                                            胞，接种于 RPMI 1640 完全培养基中，调整细胞密度为
        Biosharp生物公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美国Mil-
                                                            1×10 个/mL，然后接种至 6 孔板中，每孔 2 mL。细胞分
                                                                5
        lipore公司）；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限
                                                            组和给药方法同“2.2”项下，每组均设置3个复孔。培养
        公司合成；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水
                                                            48 h后，用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，采用紫外分
        为蒸馏水。                                               光光度法检测 RNA 浓度及纯度后，将 RNA 逆转录合成
        1.3  细胞株                                            cDNA，并进行 PCR 扩增。反应体系（共 20 μL）：cDNA
            人结肠癌细胞株 HCT116 购自中国医学科学院细                       模板 2 μL，Mix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，ddH2O 7.2
        胞库。                                                 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退
        2 方法                                                火 30 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 个循环。以β-actin 作为内
        2.1 细胞培养及样品溶液制备                                     参，采用 2   －ΔΔCt 法计算各目标基因 mRNA 的表达水平。
            将 HCT116 细胞培养于含 10％胎牛血清、1％青-链                   试验重复3次。引物序列及产物长度见表1。
        霉素的 RPMI 1640 完全培养基中，将细胞置于 37 ℃、                                表1 引物序列及产物长度
        5％CO2培养箱中贴壁培养2～3 d，待细胞融合度至80％                            Tab 1 Primer sequence and product length
        左右时，用 0.25％胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。                                                                     产物长
                                                            基因名称 上游引物序列（5′-3′）       下游引物序列（5′-3′）
        本研究选用传代 10～20 代的 HCT116 细胞进行试验。                                                                 度，bp
                                                            β-actin  AGCACTGTGTTGGCGTACAG  TCCCTGGAGAAGAGCTACGA  194
        将 50 μg 紫草素溶解于 50 μL 的 DMSO 中，制备成质量
                                                            LC3  AATCCCGGTGATCATCGAGC  GCCGGATGATCTTGACCAAC  119
        浓度为 1 mg/mL 的母液，分装后冻存于－20 ℃冰箱中，                     Beclin-1 CCGCAAGATAGTGGCAGAA  CGACCCAGCCTGAAGTTAT  264
        备用。使用时，用RPMI 1640完全培养基将母液分别稀                        p62  ACATAGCTTGCCTAATGGCTTTCAC  ACATAGCTTGCCTAATGGCTTTCAC 139


        ·52 ·   China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 1                                    中国药房    2021年第32卷第1期
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