Page 41 - 《中国药房》2021年第1期
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to relieve the OGD induced astrocytic injury，with protective effect.
        KEYWORDS     Xiaoxuming decoction；Drug-contained serum；Astrocyte；Oxygen and glucose deprivation；Protective effect；
        Mechanism


            祛风通络法及其代表方小续命汤在治疗缺血性中                          LDH 检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：
        风的临床应用中具有悠久的历史，其疗效受到历代医家                           A020-1-2）；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）兔多克隆抗体
        的广泛认可     [1-3] 。在此基础上，大量基于现代药理学的研                 （丹麦 DAKO 公司，批号：3064）；MnSOD 鼠多克隆抗体
        究开始探讨小续命汤对脑缺血后神经元的保护作用和                            （美国 Abcam 公司，批号：74231）、荧光染料 Cy3 标记的
        机制  [4-9] ，为其临床应用提供了更多的证据支持。                       羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批号：A0516）、异硫氰
            近年来，有学者提出，脑保护研究思路应当突破神                         酸荧光素（FITC）标记的羊抗鼠IgG二抗（批号：A0568）、
        经元的局限，更多地关注星形胶质细胞、脑血管内皮细                           4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（批号：C1005）、
        胞、周细胞等神经元支持成分 。星形胶质细胞是大脑                           2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）ROS 检测试剂
                                 [10]
        内数量最多的细胞，对神经元起到支持、保护和营养的                           盒（批号：S0033）均购自北京碧云天生物科技公司；其余
        作用，并参与神经系统发育、突触传递、维持神经系统内                          试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为去离子水。
        环境稳定以及能量代谢等多种生理功能，在脑缺血损伤                           1.3 动物
        的发生、发展以及修复过程中扮演着重要角色                    [11-12] 。为     SPF级新生SD大鼠10只（24 h内新生，雌雄兼用）、
        了在相对理想的环境下观察小续命汤对缺血缺氧星形                            SPF 级 SD 大鼠 25 只（7～8 周龄，雄性，体质量 200～220
                                                 [13]
        胶质细胞的影响，笔者拟借助血清药理学方法 ，将体                           g）均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物生产
        外培养的大鼠星形胶质细胞通过氧糖剥夺（Oxygen-glu-                     许可证号：SCXY（沪）2017-0005]。所有动物均饲养于
        cose deprivation，OGD）法模拟脑缺血损伤模型，采用小                复旦大学附属中山医院实验研究中心动物房[动物使用
        续命汤含药血清干预模型大鼠星形胶质细胞，观察其对                           许可证号：SYXY（沪）2016-0006]，室温 20～25 ℃，相对
        模型大鼠星形胶质细胞中乳酸脱氢酶（LDH）含量及活                          湿度 50％～60％，通风良好。大鼠自由进食饮水，适应
        性氧（ROS）和锰超氧化物岐化酶（MnSOD）表达的影                        性饲养1周后进行实验。动物实验严格按照《复旦大学
        响，研究其对大鼠星形胶质细胞的保护作用及可能的分                           附属中山医院实验动物管理规范》进行操作。
        子机制。                                               2 方法
        1 材料                                               2.1  小续命汤提取物制备
        1.1  仪器                                                参照《千金要方》小续命汤组方 ，将麻黄、桂枝、芍
                                                                                          [15]
            EBA280型台式离心机（德国Hettich公司）；HH-6型                药、川芎、黄芩、杏仁、附子、甘草、人参、防己、防风、生姜
        恒温水浴锅（上海析达仪器有限公司）；Aquelix 5型纯水                     以1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1.5 ∶ 5的质量比混合，加水浸
        机（美国 Milipore 公司）；EVL-3S 型超净工作台（珠海市                泡1 h后，以10倍体积水（mL/g）煎煮1 h，滤取上清液后，
        再鑫仪器有限公司）；BB15 型 CO2培养箱（德国 Heraeus                 再加入 10 倍体积水（mL/g）煎煮 1 h，共重复煎煮 3 次。
        公司）；BX21 型荧光倒置相差显微镜（日本 Olympus 公                   合并3次所得药汁并浓缩至1 g/mL，冷却后加入无水乙
        司）；ELx800型全自动酶标仪（美国BioTek公司）。                      醇使其达到总体积的 75％，再以磁力搅拌过夜，然后以
        1.2  药品与试剂                                         3 000 r/min 离心 20 min 后取上清液。收集药渣，用 1 倍
            参照《千金要方》，小续命汤由麻黄 3 g、桂枝 3 g、芍                  体积75％乙醇（mL/g）浸泡1 h，过滤后收集上清液，与离
        药3 g、川芎3 g、黄芩3 g、杏仁3 g、附子 3 g、甘草3 g、人              心所得的上清液合并，于 80 ℃恒温蒸发 1 h 除去乙醇，
                                                [14]
        参 3 g、防己 3 g、防风 4.5 g、生姜 15 g 组方而成 。上述             得到质量浓度为 1 g/mL（以生药量计算）的小续命汤提
        中药材均通过复旦大学附属中山医院药剂科采购，并由                           取物，经高压灭菌后于－20 ℃保存备用。
        上海虹桥药业有限公司中药饮片厂鉴定，均符合2015年                         2.2 含药血清、星形胶质细胞的制备及给药处理
                          [15]
        版《中国药典》（一部） 质量标准。                                  2.2.1  小续命汤含药血清制备           将25只雄性SD大鼠适
            杜氏磷酸缓冲液（D-PBS，批号：C14190500BT）、                 应性饲养1周后，参考前期小续命汤对脑缺血保护作用
        DMEM/F12完全培养基（批号：C11330500BT）、0.25％胰               的量效研究结果 ，采用2.5 mL小续命汤提取液（相当于
                                                                         [4]
        蛋白酶（批号：25200-072）、胎牛血清（批号：10099-141）               生药量 2.5 g）对大鼠灌胃给药，早晚各 1 次，连续 5 d。
        均购自美国 Gibco 公司；DNA 酶（批号：D8071-25）购自                末次给药后 1 h 时，每只大鼠腹腔注射水合氯醛（350
        上海所爱生物科技有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（Tri-                        mg/kg）麻醉，经腹主动脉取血 5 mL。血样在 37 ℃下静
        ton X-100，批号：AR-0341）、聚山梨酯 20（Tween-20，批           置1 h后，以3 000 r/min离心10 min，取上层血清置于离
        号：T8220-100）均购自国鼎环科（北京）技术有限公司；                     心管中，于 56 ℃水浴灭活 30 min，再经 0.22 μm 滤膜过


        中国药房    2021年第32卷第1期                                                China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 1  ·35 ·
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