Page 56 - 《中国药房》2020年第24期

contents of MMP and ATP（except for low concentration group），protein expression of Bcl-2，Nrf2 and HO-1 as well as protein
expression of Cyt-C in mitochondria were increased significantly；ROS level（except for low concentration group）and Bax protein
as well as protein expression of Cyt-C were decreased significantly. The protein expression of Nrf2 and HO-1 were increased
significantly in positive control group （P＜0.05 or P＜0.01）， but it was lower than that of total ginsenosides groups.
CONCLUSIONS：Total ginsenosides can improve D-galactose induced senescence of P12 cells，the mechanism of which may be
related to activating Nrf2 antioxidant signal pathway to antagonize D-galactose induced oxidative stress and alleviating
mitochondrial dysfunction.
KEYWORDS Total ginsenosides；D-galactose；PC12 cells；Senescence；Mitochondria；Apoptosis related protein；Oxidative
damage related protein

衰老是神经退行性疾病发生的主要诱因，包括阿尔 Express公司，批号：HY-B0215，纯度：≥97％）；灭活胎牛
茨海默病（AD）、帕金森病（PD）在内的多种神经退行性 血清和 RPMI 1640 培养基（美国 Hyclone 公司）；胰蛋白
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疾病均表现出了典型的年龄依赖性 。这提示加速衰老 酶和青霉素-链霉素双抗（美国 Molecular Research Cen-
的因子可能参与了神经退行性疾病的发生发展，而延缓 ter公司）；细胞周期检测试剂盒、RIPA裂解液、线粒体细
衰老可能会减少该类疾病的发生。衰老机制复杂，涉及 胞分离试剂盒、2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）
基因组稳定性下降、表观遗传改变、营养失调、蛋白水解 荧光探针溶液、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、三磷
异常、端粒缩小、干细胞耗竭、线粒体功能障碍等多种因 酸腺苷（ATP）检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、
素 [2-3] 。其中，鉴于神经元代谢过程的高需氧量，线粒体 罗丹明123染色工作液、细胞核蛋白抽提试剂盒、特超
功能紊乱可能是神经元衰老的核心因素 ，同时也是引 敏 ECL 化学发光试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒
[4]
[5]
发神经退行性疾病的关键因素 。因此，寻找能够有效 （上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为 C1052、
维系线粒体功能进而延缓衰老的药物，对于防治神经退 P0013K、C3601、S0033-1、C0602、S0026、P0012S、
行性疾病和衰老均具有十分重要的意义。 C2007、P0027、P0018AS、S0033S）；异 硫 氰 酸 荧 光 素
人参是被学者普遍认可的可以延年益寿的传统中 （FITC）-膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡检测细胞试剂盒
药材之一，其具有大补元气、生津止渴、安神益智、补脾 （美国 BD Pharmingen 公司，批号：556547）；十二烷基硫
益肺的功效 [6-8] 。《神农本草经》提到，人参可以“补五脏， 酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配置液（北
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安精神，定魂魄，止惊悸，久服轻身延年”。现代药理学 京索莱宝科技有限公司）；CCK-8试剂盒（美国Boster Bi-
研究表明，人参中的皂苷类成分可通过抑制氧化应激而 ological Technology公司，批号：AR1199）；兔源B淋巴细
延缓衰老，并对 AD、PD 等多种神经退行性疾病具有治 胞瘤 2（Bcl-2）及其相关 X 蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脱
疗作用 [10-12] ，但其作用机制尚不明确。PC12细胞是常用 氢酶（GAPDH）多克隆抗体（北京艾斯廷科技有限公司，
的神经细胞株，是来源于成年大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞 批号分别为 ab196495、ab53154、ab245357）；兔源细胞色
瘤的细胞系。本研究利用D-半乳糖诱导PC12细胞损伤 素C（Cyt-C）、细胞色素C氧化酶Ⅳ（Cox Ⅳ）多克隆抗体
模拟衰老模型，拟探索人参总皂苷对该细胞衰老的改善 （上 海 爱 必 信 生 物 科 技 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为
作用及其可能机制，旨在为深入研究人参总皂苷防治神 abs130083、abs131570）；兔源核因子 2 相关因子 2（Nrf2）
经退行性疾病和衰老提供参考。 单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号：
1 材料 12721S）；鼠源血红素氧合酶 1（HO-1）、核纤层蛋白 B
1.1 仪器 （Lamin B）单克隆抗体（美国 Proteintech 公司，批号分别
iBright FL 1000 型智能凝胶成像系统、Forma TM 3 型 为66743-1-Ig、66095-1-Ig）；碱性磷酸酶标记的山羊抗兔
CO2细胞培养箱、EVOS FL Auto型全自动细胞成像系统 IgG二抗（美国Sigma公司，批号：A3687）；其余试剂均为
（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Infinite 200 Pro型 分析纯，水为超纯水。
®
全自动酶标仪（上海帝肯贸易有限公司）；Flow Sight 型 1.3 细胞
多维全景流式细胞仪（德国 Merck Millipore 公司）；Mini 大鼠 PC12 细胞株购自中国科学院（上海）细胞库，
Protean 型蛋白电泳仪（美国 Bio-Rad 公司）；Seahorse 由长春中医药大学人参科学研究院实验室留种保存。
XFp型能量代谢分析仪（美国Agilent公司）。 2 方法与结果
1.2 药品与试剂 2.1 细胞培养
人参总皂苷[上海源叶生物科技有限公司，批号： PC12 细胞用含 10％灭活胎牛血清的 RPMI 1640 培
S25997，纯度：≥80％（以人参皂苷 Re 计）]；D-半乳糖 养基，在 37 ℃、5％CO2 培养箱中培养，当细胞融合至
（大连美仑生物科技有限公司，批号：MB1853-1，纯 80％～90％且生长状态良好时，用胰蛋白酶消化，传代，
度：≥97％）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，美国Med Chem 自第4代起用。

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