Page 59 - 《中国药房》2020年第24期

150 书提取线粒体蛋白和胞浆蛋白。使用BCA蛋白浓度测
定试剂盒测定蛋白浓度，于沸水中加热 8 min变性。取

100 适量变性蛋白进行SDS-PAGE，转膜0.5 h，5％脱脂奶粉
％ ##
ATP含量， ＊＊ 室温封闭1.5 h，在4 ℃条件下加入Bcl-2、Bax、Cyt-C、Cox
50 Ⅳ、GAPDH一抗（稀释比例为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用
PBST溶液洗涤3次（每次5 min），再加入二抗（稀释比例
为1∶10 000），室温孵育1 h，用PBST溶液洗涤3次（每次
0
5 min）。加入特超敏ECL化学发光试剂显色，于凝胶成
正常对照组 模型组 人参总皂苷 人参总皂苷
低浓度组 高浓度组 像系统上成像，采用 J 1.52a Image 软件分析，分别以
##
注：与正常对照组， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01 Bcl-2、Bax 与内参 GAPDH 的灰度值比值表示细胞内
＊＊
##
Note：vs. normal control group， P＜0.01；vs. model group，P＜
＊＊
Bcl-2、Bax 蛋白的表达水平，以 Cyt-C 与 GAPDH 的灰度
0.01 值比值表示胞浆内 Cyt-C 蛋白的表达水平，以 Cyt-C 与
图 4 人参总皂苷对 PC12 衰老细胞中 ATP 的影响
Cox Ⅳ的灰度值比值表示线粒体内Cyt-C蛋白的表达水
（n＝3）
平。试验重复3次。结果，与正常对照组比较，模型组细
Fig 4 Effects of total ginsenosides on ATP of PC12 se-
胞内 Bcl-2 和线粒体内 Cyt-C 蛋白的表达水平均显著降
nescent cells（n＝3）
低，细胞内 Bax 和胞浆内 Cyt-C 蛋白的表达水平均显著
消化细胞，1 000 r/min离心5 min，用PBS漂洗2次，加入
升高（P＜0.01）。与模型组比较，人参总皂苷低、高浓度
预先用PBS稀释的DCFH-DA荧光探针溶液 100 μL，在
组细胞内 Bcl-2 和线粒体内 Cyt-C 蛋白的表达水平均显
37 ℃避光条件下孵育 30 min，期间每 5 min 混匀 1 次，
著升高，细胞内 Bax 和胞浆内 Cyt-C 蛋白的表达水平均
使探针和细胞充分接触；再以 1 000 r/min离心5 min，弃
显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见图6、表4。
去上清液，细胞用PBS漂洗3次，以充分除去未进入细胞
的 DCFH-DA，免除干扰；最后用 PBS 200 μL 重悬细胞， Bax 21 kDa
使用流式细胞仪在488 nm波长下检测细胞中ROS的含
量，结果以各组与正常对照组的检验结果比值表示。试 细胞 Bcl-2 28 kDa
验重复 3 次。结果，与正常对照组比较，模型组细胞中 GAPDH 37 kDa
ROS含量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，人参总皂
苷高浓度组细胞中 ROS 含量显著降低（P＜0.01），详见 Cyt-C 14 kDa
胞浆
图5。
GAPDH 37 kDa
300
＊＊
Cyt-C 14 kDa
200 ##
％ 线粒体
ROS含量， Cox Ⅳ 17 kDa
高浓度组
低浓度组
100 正常对照组 模型组 人参总皂苷 人参总皂苷
图 6 人参总皂苷对 PC12 衰老细胞 Bcl-2、Bax、Cyt-C
蛋白表达影响的电泳图
0
Fig 6 Electrophoresis diagrams of the effects of total
正常对照组 模型组 人参总皂苷 人参总皂苷
低浓度组 高浓度组 ginsenosides on protein expression of Bcl-2，
注：与正常对照组， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01
##
＊＊
Bax and Cyt-C in PC12 senescent cells
Note：vs. normal control group， P＜0.01；vs. model group，P＜
＊＊
##
0.01 2.11 细胞氧化损伤相关蛋白表达检测
图5 人参总皂苷对PC12衰老细胞中ROS含量的影响 采用 Western blotting 法检测。按“2.4”项下方法分
（n＝3） 组、培养。培养24 h后，按“2.10”项下方法提取细胞总蛋
Fig 5 Effects of total ginsenosides on ROS content of 白。采用细胞核蛋白抽提试剂盒按说明书提取核蛋白，
PC12 senescent cells（n＝3） 检测氧化损伤相关蛋白Nrf2、HO-1表达，一抗稀释比例
2.10 细胞凋亡相关蛋白表达检测 为1 ∶ 1 000，二抗稀释比例为1 ∶ 10 000，另设阳性药物组
采用 Western blotting 法检测。按“2.4”项下方法分 和阳性对照组进行比较。阳性药物组细胞用含5 mmol/L
组、培养。培养 24 h 后，在冰浴条件下，用 RIPA 裂解液 NAC 的完全培养液培养 1 h，阳性对照组细胞先用含 5
提取细胞总蛋白。按线粒体细胞分离试剂盒操作说明 mmol/L NAC 的完全培养液培养 1 h，再用含 20 mg/mL

中国药房 2020年第31卷第24期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 24 ·2997 ·