Page 51 - 《中国药房》2020年第24期
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2.3 含药培养基制备 多糖组、黄芪皂苷组、黄芪黄酮组，每组设3个复孔。按
黄芪多糖、黄芪皂苷和黄芪黄酮分别用专用培养基 “2.5”项下方法加药、预干预、辐射、继续干预适宜时间
溶解，具体方法为：取相应药物 20 mg，分别溶于专用 （参考“2.4”项下结果初设继续干预时间，再根据检测结
培养基 20 mL 中，使其质量浓度均为 1 000 μg/mL，再分 果细分干预时间，即继续干预 0.5、2、12、24 h）。弃去培
别用专用培养基进行稀释，使其质量浓度分别均为100、 养基，细胞用 4 ℃甲醇固定 20 min 后，于 0.5％Triton-X
75、50、25 μg/mL。 100 试剂孵育 10 min；用 5％脱脂牛奶封闭 1 h 后，加入
2.4 细胞增殖能力检测 53BP1抗（稀释比例为1 ∶ 500），室温孵育2 h，以PBST溶
采用 CCK-8 法检测。收集对数生长期的 BMSCs， 液洗涤 3 次，再加入相应二抗（稀释比例为 1 ∶ 1 000），室
用0.25％胰蛋白酶消化后，以专用培养基制成单细胞悬 温孵育 1 h，以 PBST 溶液洗涤 5 次。细胞核以 DAPI 进
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液，按 100 μL/孔（即 2×10 个/孔）接种于 5 个 96 孔板中， 行复染并制片，使用荧光显微镜观察并拍照，每个样品
将细胞随机分为空白组、辐射组、黄芪多糖组、黄芪皂苷 计数 100 个细胞并计算其中 53BP1 焦点簇数量（53BP1
组、黄芪黄酮组。待细胞贴壁后，弃去培养基，各药物组 蛋白显红色荧光）。
分别加入含不同质量浓度（25、50、75、100 μg/mL，浓度 2.7 统计学方法
按前期预试验结果设置）黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮 采用 SPSS 21.0 软件对数据进行统计分析。采用
的专用培养基100 μL，空白组和模型组加入专用培养基 Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。计量资料符合正态
100 μL，每个浓度设 6 个复孔。预干预培养 1 d 后，吸弃 分布者以 x±s 表示，不符合正态分布者以 M（P25，P75）
培养基 50 μL，空白组用 0.3 mm 厚的铅板挡住，其余各 表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组比较前
组用X射线按“2.2”项下条件进行直接照射，照射后弃剩 者采用 Student’s t 检验，后者采用秩和检验。计数资料
余培养基，重新加入上述相应不含药或含药的专用培养 以千分率表示，采用秩和检验。P＜0.05 表示差异有统
基100 μL，置于培养箱中继续干预。分别于继续干预1、 计学意义。
2、3、4、5 d 时按 CCK-8 试剂盒说明书操作，使用酶标仪 3 结果
在490 nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。试验重复 3.1 黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮对 BMSCs 增殖的
3 次，根据 OD 值选取后续试验黄芪多糖、黄芪皂苷、黄
影响
芪黄酮的给药浓度和辐射后继续干预时间。 不同质量浓度黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮继续
2.5 细胞微核形成情况检测
干预不同时间对BMSCs增殖的影响结果见表1～表3。
采用胞浆分裂阻滞微核法检测。收集对数生长期
表1 不同质量浓度黄芪多糖继续干预不同时间对BM-
的 BMSCs，用 0.25％胰蛋白酶消化后，以专用培养基制
SCs增殖的影响结果（x±±s，n＝3）
成单细胞悬液，按 1 mL/孔（即 1×10 个/孔）接种于 24 孔
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Tab 1 Effects of different concentrations of astraga-
板中，将细胞随机分为空白组、辐射组、黄芪多糖组、黄
lus polysaccharide on the proliferation of BM-
芪皂苷组、黄芪黄酮组，每组设 3 个复孔。待细胞贴壁
SCs for different time（x±±s，n＝3）
后，按“2.4”项下方法加药、预干预、辐射，重新加入专用
继续干预 OD值
培养液后，继续干预（药物组的给药浓度和继续干预时 空白组 辐射组
时间，d 25 μg/mL 50 μg/mL 75 μg/mL 100 μg/mL
间均参考“2.4”项下结果）。各组细胞加入1 mg/mL的细 1 0.285±0.019 0.152±0.026 ＊ 0.234±0.037 0.336±0.029 ＊## 0.275±0.031 0.222±0.024
胞松弛素B 1 μL，放入细胞培养箱培养48 h后弃去培养 2 0.483±0.070 0.345±0.037 ＊ 0.513±0.033 0.559±0.041 ＊## 0.521±0.041 0.468±0.037
#
＊#
基，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH＝7.4）洗两次，在通风橱中 3 0.795±0.038 0.613±0.039 ＊＊ 0.736±0.045 0.845±0.037 ## 0.724±0.052 0.729±0.049
4 0.981±0.048 0.814±0.028 ＊ 0.938±0.069 1.113±0.056 ＊## 0.949±0.098 0.876±0.055
用卡诺固定液固定30 min，弃去固定液，反扣培养皿，在 5 1.226±0.064 1.023±0.042 ＊ 1.135±0.032 1.389±0.046 ＊## 1.212±0.095 0.901±0.074 ＊
#
通风橱中干燥 30 min，用吖啶橙染料染色 30 s。用荧光
注：与空白组比较， P＜0.05， P＜0.01；与辐射组比较，P＜
＊
＊ ＊
#
显微镜观察记录1 000个双核细胞中有微核的细胞数量 0.05，P＜0.01
##
和 1 000 个双核细胞中微核的总数量（微核呈圆形或椭 Note：vs. blank group， P＜0.05， P＜0.01；vs. radiation group，
＊
＊ ＊
##
圆形，游离于主核之外），计算微核细胞率和细胞微核 # P＜0.05，P＜0.01
率，以千分率（‰）表示，微核细胞率＝（带微核的细胞总 表1～表3结果显示，与空白组比较，辐射组各时间
数/总的双核细胞数）×1 000‰，细胞微核率＝（微核总数 点的 OD 值显著降低，提示 BMSCs 增殖受到明显抑制
目/总的双核细胞数）×1 000‰。试验重复3次。 （P＜0.05或P＜0.01）。与辐射组比较，25 μg/mL黄芪多
2.6 细胞中53BP1焦点簇数量的检测 糖继续干预2 d，25 μg/mL黄芪皂苷继续干预1～3 d，25
采用免疫荧光法检测。取无菌的12孔板，每孔加入 μg/mL 黄芪黄酮继续干预 2～3 d，50 μg/mL 黄芪多糖继
20 mm×20 mm 已灭菌盖玻片，用紫外线照射 1 h。取对 续干预 1～5 d，50 μg/mL 黄芪皂苷、黄芪黄酮继续干预
数生长期 BMSCs，用 0.25％胰蛋白酶消化后，以专用培 2～4 d，75 μg/mL 黄芪多糖、黄芪皂苷继续干预 2 d 时
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养基制成单细胞悬液，按 2 mL/孔（即 4×10 个/mL）接种 BMSCs 的 OD 值均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。综
于上述12孔板中，将细胞随机分为空白组、辐射组、黄芪 合考虑 BMSCs 的生长状况，将后续试验的药物浓度确
中国药房 2020年第31卷第24期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 24 ·2989 ·
