Page 45 - 《中国药房》2020年第24期
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1.4 细胞                                             液。以 0.1％碳酸钠溶液为空白对照进行调零，采用全
            小鼠淋巴瘤细胞 YAC-1 由中国医学科学院医药生                      自动生化仪检测各样品在 600 nm 波长处的 OD 值。随
        物技术研究所提供。                                          后将小鼠安乐处死，于无菌条件下取出其肝、脾和胸腺
        2 方法                                               组织，称定质量，计算其免疫器官（胸腺、脾）脏器指数、
        2.1 药液的制备                                          吞噬指数：脏器（胸腺、脾）指数＝脏器（胸腺、脾）质量
            将黄芪地上、地下部分分别经 40 ℃真空干燥至恒                       （g）/体质量（g）×100％；吞噬指数＝[0.125×（lgOD2 min－
                                                                                             [11]
        定质量，然后分别加 5 倍量（mL/g）水进行煎煮，每次煎                      lgOD10 min ）]/3×体质量×（肝质量+脾质量） 。
        煮1 h，共3次。分别合并两者的3次水煎液并浓缩为10                        2.5 小鼠脾组织中自然杀伤（NK）细胞活性检测
        g/mL（以生药量计）的药液，备用。                                     靶细胞制备：取YAC-1细胞在37 ℃、5％CO2培养箱
        2.2 分组、造模与给药                                       中培养 24 h，然后以 1 000 r/min 离心 5 min，收集细胞沉
            将240只小鼠分为4批，每批60只，雌雄各半。将4                      淀，采用 RPMI 1640 培养基将其重悬，并调整细胞密度
                                                                  5
        批小鼠分别按照性别和体质量随机分为6组：空白组、模                          为 5×10 个/mL。效应细胞制备：取第 2 批小鼠，在末次
        型组和黄芪地上、地下部分的低、高剂量组[剂量均为3、                         给药后 12 h（期间禁食不禁水），将其安乐处死，于无菌
        6 g/kg（均以生药量计）；黄芪的临床建议用量为 9～30                     条件下取出其脾组织，用眼科剪将脾组织剪碎，然后以
         [3]
        g ，相当于小鼠的日用量 1.8～6 g/kg（以生药量计），笔                   1 000 r/min离心5 min，收集组织沉淀；采用RIPA裂解液
        者结合上述临床用量换算结果和前期预实验结果将黄                            将组织裂解，并以 Hank’s 液将其制成细胞密度为 2×10                 7
        芪给药组的低、高剂量分别设置为 3、6 g/kg]，每组 10                    个/mL 的脾细胞悬液，在 37 ℃、5％CO2培养箱中培养；
        只。空白组和模型组小鼠灌胃生理盐水，给药组小鼠分                           取生长良好的脾细胞（传代 4～6 代），用新鲜配制的
                                                                                            5
        别灌胃相应浓度的药物，灌胃体积均 10 mL/kg；每日 1                     DMEM 培养基调整细胞密度为 4×10 个/mL，作为效应
        次，连续给药 30 d。除空白组外，其余各组小鼠均自给                        细胞。效应细胞-靶细胞相互作用：取靶细胞和效应细
        药第 24 天起腹腔注射环磷酰胺 40 mg/（kg·d），每天 1                 胞悬液各100 μL，加至96孔培养板中，将细胞分为靶细
                                        [9]
        次，连续注射 3 d，建立免疫低下模型 。若小鼠存在严                        胞自然释放组（含靶细胞悬液 100 μL 和效应细胞悬液
        重脱毛、食欲下降、精神不振、脾脏萎缩、肝脏发白、胸腺                         100 μL）和靶细胞自然释放组（含靶细胞悬液100 μL、效
                                           [9]
        受损等情况，表明免疫低下模型建立成功 。                               应细胞悬液100 μL和1％的乙基苯基聚乙二醇），并设置
        2.3  小鼠血清中Ig、炎症因子和溶血素水平检测                          无靶细胞悬液和效应细胞悬液（只含 1％乙基苯基聚乙
            末次给药后 1 h，取第 1 批小鼠，自右眼内眦静脉取                    二醇）的对照组，每组均设3个复孔。将所有组别培养液
        血约 1.0 mL，转移至 EP 离心管中，以 5 000 r/min 离心 5           均置于37 ℃、5％CO2培养箱中培养4 h后，取出，然后以
        min，收集血清，备用。按照相应试剂盒说明书操作，分                         1 500 r/min 离心 10 min，每孔吸取上清液 100 μL，置于
        别检测血清中Ig（IgM、IgG、IgA）和炎症因子（NO、IL-2、                96孔板中，加乳酸基质液100 μL，室温孵育10 min后，每
        IL-6、TNF-α）的水平。另取血清 0.1 mL，以生理盐水                   孔加入1 mol/L盐酸溶液30 μL，混匀。采用酶标仪测定
        稀释 200 倍，然后取稀释后的血清 1.0 mL、4％绵羊红                    各孔在 490 nm 波长处的 OD 值，计算 NK 细胞活性：NK
        细胞悬液 0.5 mL、10％豚鼠血清 1.0 mL，置于同一试                   细胞活性＝（对照组OD值－靶细胞自然释放组OD值）/
        管中，并以等体积生理盐水替代血清作为对照，分别                            （靶细胞自然释放孔 OD 值－靶细胞自然释放孔 OD
        于 37 ℃水浴 0.5 h，取出后冰浴终止反应。取上清液                      值）×100％。
        1.0 mL，加都氏试剂 3 mL，采用分光光度法测定各管                      2.6  小鼠脾淋巴细胞增殖能力检测
        在 540 nm 波长处的光密度（OD）值。另取 4％绵羊红                         取“2.5”项下细胞密度为 2×10 个/mL的小鼠脾细胞
                                                                                         7
        细胞悬液 0.25 mL、都氏液 3.75 mL 于同一试管中，测                  悬液，以 1 000 r/min 离心 15 min，收集沉淀，采用 RPMI
        定绵羊红细胞悬液的半数溶血值，然后按公式计算样                            1640培养基将细胞重悬并调整密度为3×10 个/mL。将重
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        品的半数溶血值（半数溶血值＝血清样品的 OD 值×                          悬的细胞悬液加至24孔培养板中（1 mL/孔），每组均设置
                                            [10]
        200/羊红细胞悬液半数溶血时的 OD 值） ，以半数溶                       两孔：其中一孔加入刀豆蛋白试液75 μL，作为刀豆蛋白
        血值来反映血清溶血素水平。                                      诱导孔；另一孔加入含青霉素-链霉素双抗（100 U/mL）和
        2.4 小鼠免疫器官脏器指数和吞噬指数检测                              10％胎牛血清的 RPMI 1640 培养基 75 μL，作为对照
            取“2.3”项下取血后的小鼠，称定其体质量，并在末                      孔。将细胞置于37 ℃、5％CO2培养箱中培养3 d。吸弃
        次给药后12 h（期间禁食不禁水），经小鼠左眼内眦静脉                        上清液，加入不含血清和青霉素-链霉素双抗的 RPMI
        注入稀释 4 倍的印度墨汁（0.1 mL/10 g），立即计时。在                  1640 培养基 0.7 mL 和 5 mg/mL 四氮唑盐试液 50 μL，继
        注入墨汁后的第2、10 min时，分别从小鼠右眼内眦取血                       续在 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 4 h。取出后，采用酶
        约1.0 mL，以5 000 r/min离心5 min，收集血清。取血清               标仪测定各孔在570 nm波长处的OD值，计算各组细胞
        20 μL，加入 0.1％碳酸钠溶液 2 mL，作为待测样品溶                    刀豆蛋白诱导孔 OD 值与对照孔 OD 值的差值，差值越


        中国药房    2020年第31卷第24期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 24  ·2983 ·
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