Page 37 - 《中国药房》2020年第24期

脑卒中是威胁人类健康的重大疾病，发病率呈逐年 机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；BSA124S型分
升高趋势，具有死亡率高、致残率高、复发率高等特 析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；THZ-100
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点 。该病分为缺血性卒中（Ischemic stroke，IS）和出血 型恒温摇床（上海一恒仪器有限公司）；QL901型涡旋仪
性卒中（Hemorrhagic stroke，HS），其中超过 75％的脑卒 （海门市其林贝尔仪器有限公司）。
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中为 IS 。IS 是由大脑局部血流循环障碍、脑组织缺血 1.2 药品与试剂
缺氧所导致的神经功能损伤综合征，其发病机制与氧化 紫铆花素标准品（上海源叶生物科技有限公司，批
应激、能量代谢紊乱、炎症、细胞凋亡等多种因素密切相 号：T18J6C1，纯度：≥98％）；GOD（北京索莱宝科技有
关 。脑缺血时产生大量活性氧（ROS），机体氧化-抗氧 限公司，批号：329J021）；胎牛血清（FBS，以色列 BI 公
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化系统失衡 [3-4] ，诱导线粒体内、外膜发生脂质过氧化反 司，批号：1928625）；青霉素-链霉素双抗溶液（批号：
应，线粒体氧化应激加重，线粒体膜电位（MMP）下降难 30002317）、胰蛋白酶消化液（批号：30119014）、杜氏磷
以维持线粒体的氧化磷酸化过程，使得三磷酸腺苷 酸盐缓冲液（D-PBS，pH＝7.4，批号：21031012）、DMEM
（ATP）合成显著下降，细胞呼吸与能量转换紊乱，进而导 高糖培养基（批号：1001303）均购自美国 Corning 公司；
致促炎因子释放，加重炎症反应，诱导神经细胞凋亡，进 二甲基亚砜（DMSO，美国 MP 公司，批号：Y181007）；
一步加重神经损伤 [5-7] 。可见，线粒体是细胞能量代谢的 CCK-8 试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号：
主要场所，以线粒体为靶点治疗IS的研究策略受到了学 C6901030）；膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶
者的广泛关注。目前，临床常用的IS治疗手段包括溶栓 （Annexin Ⅴ-FITC/PI）双染色法细胞凋亡检测试剂盒
药物和神经介入技术，但由于二者的治疗时间窗狭窄， （江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20190528）；
使得其治疗效果受到了严重的影响 [8-9] ，故寻找新的治疗 ROS（批号：20190606）、丙二醛（MDA，批号：20190618）、
手段迫在眉睫。 超氧化物歧化酶（SOD，批号：20190625）、过氧化氢酶
中医称脑卒中为“中风”，始见于《黄帝内经》。清代 （CAT，批号：20190628）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，
医家王清任认为，气虚血瘀为中风病的病机，历代医家 批号：20190625）、ATP（批号：20190708）检测试剂盒均
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也常以活血化瘀类中药治疗中风 。紫铆花素（Butein） 购自南京建成生物工程研究所；MMP 检测试剂盒
是从活血化瘀类中药降香中提取的主要活性成分，属于 （JC-1 染 色）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：
黄酮类化合物中的查尔酮类（结构式见图1） 。本课题 120919190613）；白细胞介素 1β（IL-1β，批号：201909）、
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组前期研究结果表明，紫铆花素可改善细胞氧化应激状 肿瘤坏死因子α（TNF-α，批号：201909）酶联免疫吸附测
态，抑制心肌细胞损伤，具有心肌保护作用 。但该化 定（ELISA）检测试剂盒均购自安徽巧伊生物科技有限
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合物是否具有神经保护作用，其作用机制是否与线粒体 公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为超
能量代谢有关尚未见报道。基于此，本研究以葡萄糖氧 纯水。
化酶（GOD）诱导的氧化应激细胞模型为对象，探讨紫铆 1.3 细胞
花素对PC12神经细胞氧化应激损伤的保护作用及其对 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系PC12神经细胞由空
线粒体功能的影响，旨在为寻找神经保护类药物提供参 军军医大学预防医学系毒理学教研室赠予。
考依据。 2 方法
2.1 细胞培养
PC12 细胞用完全培养基（即含 10％FBS、1％青霉
素-链霉素双抗的 DMEM 高糖培养基），置于 37 ℃、5％
CO2恒温培养箱中培养（培养条件下同），每2天更换1次
培养基，待细胞融合至 90％左右时，用 0.25％胰蛋白酶
消化并进行传代。
图1 紫铆花素的化学结构式 2.2 细胞分组与处理
Fig 1 Chemical structure of butein 将 PC12 细胞分为 6 组，分组与处理——正常对照
1 材料 组：完全培养基培养；模型组：含 100 mU/mL（浓度根据
1.1 仪器 前期预试验结果设置）GOD的基础培养基（即无血清的
371 型 CO2 培养箱、Multiskan Sky 型酶标仪（美国 DMEM 高糖培养基）培养 4 h；溶剂对照组：先用含 1‰
Thermo Fisher Scientific 公司）；Accuric 6 型流式细胞 DMSO 的基础培养基培养 24 h 后，再用含 100 mU/mL
仪[碧迪医疗器械（上海）有限公司]；A1型激光共聚焦荧 GOD的基础培养基培养4 h；紫铆花素高、中、低浓度组：
光显微镜（日本 Nikon 公司）；BSC-1100ⅡA2-X 型生物 先用含 2、1、0.5 μmol/L 紫铆花素（溶剂为 1‰DMSO，浓
安全柜（山东博科生物产业有限公司）；TD4型台式离心 度根据前期预试验结果设置）的基础培养基培养 24 h，

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