Page 38 - 《中国药房》2020年第24期
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再用含100 mU/mL GOD的基础培养基培养4 h。                        检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        2.3 细胞活性检测                                          3 结果
            以 5×10 个/孔将 PC12 细胞接种于 96 孔板中，待细                3.1 细胞存活率
                   4
        胞贴壁后，按“2.2”项下方法分组、处理，同时设置不含细                            与正常对照组比较，模型组细胞存活率显著降低
        胞和药物的空白对照组，每组设置5个复孔。建模培养                           （P＜0.01），提示GOD引起PC12细胞存活率下降。与模
        4 h 后，更换含 10％CCK-8 的完全培养基，于 37 ℃、5％                 型组比较，溶剂对照组细胞存活率无明显变化（P＞
        CO2 细胞培养箱中孵育 4 h，使用酶标仪在 450 nm 波                    0.05），紫铆花素高、中、低浓度组细胞存活率均显著升高
        长处检测各孔的光密度（OD）值并计算细胞存活率：                           （P＜0.05 或 P＜0.01），提示紫铆花素可提高 PC12 细胞
        细胞存活率（％）＝（OD 试验组－OD 空白对照组）/（OD 正常对照组－               氧化应激损伤后的存活率。各组细胞存活率检测结果
        OD 空白对照组 ）×100％。试验重复3次。                             见图2。
        2.4 细胞凋亡率检测                                             1.5
            以5×10 个/孔将PC12细胞接种于6孔板中，待细胞
                   5
        贴壁后，按“2.2”项下方法分组、处理，每组设置 3 个复
                                                                1.0                     ##
        孔。建模培养 4 h 后，用胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，                            ％                              ##
        D-PBS洗1次，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀                    存活率，       ＊＊                        #
        加入AnnexinⅤ-FITC和PI染色试剂各3 μL，吹匀，避光                       0.5
        孵育15 min后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。试验
        重复3次。                                                    0
                                                                    正常对    模型组   溶剂对  紫铆花素   紫铆花素  紫铆花素
        2.5  细胞内ROS含量检测                                              照组           照组  高浓度组   中浓度组  低浓度组
                                                                                    组别
                   5
            以5×10 个/孔将PC12细胞接种于6孔板中，待细胞
                                                                                                        ##
                                                                               ＊＊
                                                                                                  #
                                                               注：与正常对照组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜
        贴壁后，按“2.2”项下方法分组、处理，每组设置 3 个复
                                                            0.01
        孔。建模培养4 h后，吸弃旧培养基，D-PBS洗1次，用基                          Note：vs. normal control group， P＜0.01；vs. model group，P＜
                                                                                     ＊＊
                                                                                                         #
        础培养基将 ROS 试剂盒中的 2′，7′-二氯荧光黄双乙酸                      0.05， P＜0.01
                                                                ##
        盐（DCFH-DA）染色液稀释至 10 μmol/L，每孔加入上述                        图2 各组细胞存活率检测结果（x±±s，n＝3）
        染色液1 mL，置于37 ℃、5％CO2培养箱中孵育1 h，弃去                    Fig 2  Results of survival rate of cells in each group
        培养基，D-PBS 洗 3 次，用胰蛋白酶消化，收集细胞悬                            （x±±s，n＝3）
        液 ，1 000 r/min 离 心 5 min，弃 去 上 清 液 ，每 管 加 入         3.2  细胞凋亡率
        D-PBS 500 μL，吹匀，使用流式细胞仪检测细胞内 ROS                        与正常对照组比较，模型组细胞凋亡率显著升高
        含量。试验重复3次。                                         （P＜0.01），提示GOD可导致PC12细胞凋亡。与模型组
        2.6  细胞内 MDA、SOD、CAT、GSH-Px、ATP、IL-1β、              比较，溶剂对照组细胞凋亡率无明显变化（P＞0.05），紫
        TNF-α水平检测                                           铆花素高、中、低浓度组细胞凋亡率均显著降低（P＜
            以5×10 个/孔将PC12细胞接种于6孔板中，待细胞                     0.05 或 P＜0.01），提示紫铆花素可抑制 GOD 引起的
                   5
        贴壁后，按“2.2”项下方法分组、处理，每组设置 3 个复                       PC12细胞凋亡。各组细胞的凋亡散点图见图3，凋亡率
        孔。建模培养4 h后，按照试剂盒说明书处理细胞后，收                          检测结果见图4。
        集上清液，以比色法检测细胞内氧化损伤相关蛋白                              3.3  细胞内ROS含量
        （MDA、SOD、CAT、GSH-Px）、ATP 水平或活性，ELISA                    与正常对照组比较，模型组细胞内ROS含量显著升
        法检测细胞内炎症因子（IL-1β、TNF-α）水平。试验重复                      高（P＜0.01），提示 GOD 可导致 PC12 细胞内 ROS 生成
        3次。                                                 增加。与模型组比较，溶剂对照组细胞内ROS含量无明
        2.7 细胞MMP观察                                         显变化（P＞0.05），紫铆花素高、中、低浓度组细胞内
            以 5×10 个/孔将 PC12 细胞接种于放置有细胞爬片                   ROS含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示紫铆花
                   5
        的 6 孔板中，待细胞贴壁后，按“2.2”项下方法分组、处                       素可清除细胞内 ROS。各组细胞内 ROS 含量检测结果
        理，每组设置3个复孔。建模培养4 h后，吸弃培养基，每                         见图5。
        孔加入JC-1染色工作液1 mL，孵育20 min后，用JC-1染                   3.4 细胞内氧化损伤相关蛋白活性或水平
        色缓冲液（1×）轻轻洗 3 遍，每孔再加入完全培养基 1                            与正常对照组比较，模型组细胞内 MDA 水平显著
        mL，置于激光共聚焦荧光显微镜下观察、拍照。                              升高，SOD、CAT、GSH-Px 活性均显著降低（P＜0.05 或
        2.8  统计学方法                                          P＜0.01），提示 GOD 可诱导 PC12 细胞发生脂质过氧化
            采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。结果以                      反应，导致脂质过氧化产物堆积，氧化-抗氧化体系失
        x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t                        衡，抗氧化酶活性下降。与模型组比较，溶剂对照组上


        ·2976 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 24                                 中国药房    2020年第31卷第24期
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