Page 56 - 《中国药房》2020年23期
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2.7 细胞中NF-κB p65 mRNA表达水平的检测                        LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
            采用实时定量PCR法检测。取对数期生长的H9c2                        3 结果
                    6
        细胞，按1×10 个/孔接种于6孔板中，按“2.2”项下方法分                     3.1 各组细胞存活率和凋亡率比较
        组、造模、给药，每组设5个复孔。培养24 h后，收集细胞                            与正常对照组比较，损伤模型组中 TUNEL 阳性细
        至1.5 mL离心管中，加入Trizol试剂1 mL，静置30 min，                胞数明显增多，细胞存活率显著降低，而凋亡率显著升
        加入氯仿适量（约为离心管中试剂总体积的 1/5），涡旋                         高（P＜0.05）；与损伤模型组比较，姜黄素各剂量组中
        振荡 15 s 后，以 12 000 r/min 离心 15 min。取上清液，加           TUNEL阳性细胞数明显减少，细胞存活率均显著升高，
        入等体积异丙醇，上下颠倒混匀后冰浴10 min；以12 000                     而凋亡率均显著降低（P＜0.05），且随着姜黄素剂量的
        r/min 离心 10 min，弃去上清液，沉淀加入 70％乙醇 1                  增加，有细胞存活率逐渐升高、凋亡率逐渐降低的趋势。
        mL，混匀；以 12 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，沉淀              各组细胞存活率和凋亡率的检测结果见表1，TUNEL法
        风干后加入无 RNA 酶水溶解，按反转录试剂盒说明书                          显微图见图 1（图中，DAPI 标记细胞核，TUNEL 表示凋
        操作，将RNA反转录为cDNA，再按RT-PCR试剂盒说明                       亡阳性细胞，Merge表示两者叠加）。
        书操作进行 PCR 扩增。扩增体系（共 100 µL）：10×扩增                   表 1   各组细胞存活率和凋亡率的检测结果（x±±s，
        缓冲液10 µL，4×dNTPs 8 µL，上、下游引物各1 µL，模板                      n＝3）
        cDNA 1 µL，Taq DNA 聚合酶 1 µL，加水至 100 µL。扩             Tab 1 Results of survival rate and apoptosis rate of
        增条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，60 ℃退火                       cells in each group（x±±s，n＝3）
        30 s，72 ℃延伸 60 s，共 30 个循环；72 ℃再延伸 10 min。
                                                            组别                 存活率，％              凋亡率，％
        NF-κ B p65 上 游 引 物 为 5′-GCTCTCTGCTCCTCCCT-          正常对照组                100              3.66±2.14
        GTTCT-3′，下游引物为 5′-GCCAAATCCGTTCACACC-               损伤模型组              54.79±2.43 ＊      59.11±8.12 ＊
                                                            姜黄素低剂量组            73.67±1.62 #      41.65±3.22 #
        GACCT-3′，产物长度为79 bp；β-actin上游引物为5′-TG-              姜黄素中剂量组            80.55±3.42 #      30.85±2.25 #
        GAGTCGGATAACTGCTCAGGAG-3′，下 游 引 物 为                 姜黄素高剂量组            93.64±2.53 #      19.11±1.98 #
        5′-AGACTGGAGTTCACCTGTGGATGG-3′，产物长度                    注：与正常对照组比较，P＜0.05；与损伤模型组比较，P＜0.05
                                                                               ＊
                                                                                                    #
        为102 bp。采用Applied Biosystems 7500 2.0.6荧光分析            Note：vs. normal control group，P＜0.05；vs. injury model group，
                                                                                    ＊
        软件进行分析，以β-actin 为内参，按 2         －ΔΔCt 法计算 NF-κB     # P＜0.05
        p65 mRNA的表达水平。上述试验重复3次。                             3.2  各组细胞中SOD活性和MDA含量比较
        2.8  细胞中 NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白表达水平的                  与正常对照组比较，损伤模型组细胞中SOD活性显
        检测                                                  著降低，而 MDA 含量显著升高（P＜0.05）；与损伤模型
            采用 Western blotting 法检测。取对数生长期的                 组比较，姜黄素各剂量组细胞中 SOD 活性显著升高，而
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        H9c2 细胞，按 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.2”项下                MDA 含量显著降低（P＜0.05），且随着姜黄素剂量的增
        方法分组、造模、给药，每组设3个复孔。培养24 h后，收                        加，有细胞中SOD活性逐渐升高、MDA含量逐渐降低的
        集细胞，加入裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白                           趋势。各组细胞中 SOD 活性和 MDA 含量的检测结果
        浓度。取蛋白 50 μg，于 100 ℃变性 5 min 后，行十二烷                 见表2。
        基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜                          3.3  各组细胞中LC3阳性表达相对荧光强度比较
        上，用封闭液室温封闭 1 h；加入 NF-κB p65、p-NF-κB                     与正常对照组比较，损伤模型组细胞中LC3阳性表
        p65、GAPDH 一抗（稀释度均为 1 ∶ 500），4 ℃孵育过夜；                达明显增多，其相对荧光强度显著升高（P＜0.05）；与损
        用 PBST 溶液清洗后，加入 HRP 标记的二抗（稀释度为                      伤模型组比较，姜黄素各剂量组细胞中LC3阳性表达有
        1 ∶ 2 000），室温孵育1 h；用PBST溶液清洗后，以显色液                  所减少，其相对荧光强度均显著降低（P＜0.05），且随着
        显影。利用化学发光成像系统成像并使用Image J 1.6.0                     姜黄素剂量的增加，LC3阳性表达相对荧光强度有逐渐
        软件分析，以目标蛋白与内参（GAPDH）的灰度值比值                          减弱的趋势。各组细胞中 LC3 阳性表达相对荧光强度
        表示目标蛋白的表达水平，以p-NF-κB p65与NF-κB p65                  的检测结果见表3、图2（图中，DAPI标记细胞核，LC3表
        蛋白的灰度值比值表示NF-κB p65的磷酸化水平。上述                        示LC3阳性表达细胞，Merge为两者叠加）。
        试验重复3次。                                             3.4  各组细胞中 NF-κB p65 mRNA 以及 NF-κB p65、
        2.9  统计学方法                                          p-NF-κB p65蛋白的表达水平比较
            采用 SPSS 19.0 软件对数据进行统计分析，采用                         与正常对照组比较，损伤模型组细胞中 NF-κB p65
        Graphpadprism 5软件作图。计量资料以x±s表示，多组                   mRNA和NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的表达水平以及
        间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用                             p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均显著升高（P＜0.05）；与


        ·2866 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 23                                 中国药房    2020年第31卷第23期
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