Page 55 - 《中国药房》2020年23期
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抗体（批号：AF1186）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山                     霉素的DMEM/F12培养基，不加细胞悬液），每组设3个
        羊抗兔 IgG 二抗（批号：A0208）、Alexa Fluor 350 标记的           复孔。培养24 h后，于避光条件下加入5 mg/mL的MTT
        山羊抗兔免疫荧光染色试剂盒（含荧光标记的IgG二抗，                         溶液 20 μL，于培养箱中室温避光孵育 4 h 后，弃去上清
        批号：P0175）、青霉素-链霉素混合溶液（批号：C0222）、                   液，然后每孔加入 DMSO 150 μL，置于振荡器上振荡 5
        二 甲 亚 砜（DMSO，批 号 ：ST038）、胎 牛 血 清（批 号 ：             min。使用酶标仪于 490 nm 波长处检测各孔的光密度
        C0227）、封闭液（批号：P0260）、抗荧光猝灭剂（批号：                    （OD）值并计算细胞存活率：细胞存活率＝（试验组细胞
        P0126）、TritonX-100 试剂（批号：P0096）、TdT 酶（批号：          平均OD值－调零组细胞平均OD值）/（正常对照组细胞
        D3106）、荧光标记液配制检测液、Trizol 试剂（批号：                    平均 OD 值－调零组细胞平均 OD 值）×100％。上述试
        R0016）、RNA 酶水（批号：R0022）、Western blotting 显色        验重复3次。
        液（批号：P0018M）均购自上海碧云天生物科技有限公                        2.4 细胞凋亡率的检测
        司；微管相关蛋白 1 轻链 3（LC3）兔单克隆抗体（武汉三                         采用TUNEL法检测。取对数期生长的H9c2细胞，
                                                                  4
        鹰生物技术有限公司，批号：14600-1-AP）；DMEM/F12                  按 5×10 个/孔接种于放有细胞爬片的 6 孔板中，按“2.2”
        培养基（北京索莱宝科技有限公司，批号：31600）；4′，6-                    项下方法分组、造模、给药，每组设 3 个复孔。培养 24 h
        二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染料（美国Abcam公司，                    后，取出细胞爬片，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清洗2
                                                           次后，置于 4％多聚甲醛溶液中于室温固定 30 min；用
        批号：AF30A5123）；上、下游引物均由赛默飞世尔科技
                                                           PBS清洗2次，用含0.3％TritonX-100试剂的PBS室温孵
       （中国）有限公司设计、合成；其余试剂均为分析纯或实
                                                           育 5 min；每孔加入 TdT 酶 5 μL 和荧光标记液配制检测
        验室常用规格，水为双蒸水。
                                                           液 45 μL，于 37 ℃避光孵育 1 h，滴加 DAPI 荧光染料避
        1.3  细胞
                                                           光孵育 5 min；用 PBST 溶液清洗 5 min×4 次以除去多余
            大鼠H9c2心肌细胞购自中国科学院上海生科院细
                                                           的染料，再以PBS清洗3次，经中性树脂封片。采用激光
        胞资源中心，于－80 ℃冻存。
                                                           扫描共聚焦显微镜对树脂片进行成像分析，对 TUNEL
        2 方法
                                                           阳性细胞（即镜下细胞核呈绿色荧光的凋亡细胞）进行
        2.1  细胞培养与传代
                                                           计数并计算细胞凋亡率。上述试验重复3次。
            取冻存的 H9c2 细胞，于 37 ℃溶解后转移至 10 mL
                                                           2.5  细胞中SOD活性及MDA含量的检测
        无菌离心管中，加至适量含10％胎牛血清及1％青霉素-
                                                               取对数生长期的 H9c2 细胞，按 5×10 个/孔接种于 6
                                                                                              5
        链霉素混合溶液的 DMEM/F12 培养基（以下简称“完全
                                                           孔板中，按“2.2”项下方法分组、造模、给药，每组设 3 个
        培养基”）中，以800 r/min离心5 min。弃去上清液，细胞
                                                           复孔。培养 24 h 后，收集细胞并加入细胞裂解液适量，
        加入适量完全培养基重悬后，接种于培养皿中，置于
                                                           于冰上裂解 30 min 后，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 15
        37 ℃、5％CO2恒温培养箱中培养（培养条件下同），定期
                                                           min，取上清液。经 BCA 法测定蛋白浓度后，分别按
        更换新鲜的完全培养基，待细胞生长融合至70％～80％
                                                           WTS-8 法和显色法以酶标仪检测 SOD 活性和 MDA 含
        时进行传代。
                                                           量，严格按照相应试剂盒说明书操作。上述试验重复
        2.2  分组、造模与给药                                      3次。
                        [7]
            参照文献方法 ，收集对数生长期的 H9c2 细胞，随                     2.6  细胞中LC3阳性表达相对荧光强度的检测
        机分为正常对照组、损伤模型组[50 μmol/L H2O2 （以不含                     采用免疫荧光法检测。取对数期生长的 H9c2 细
        血清和青霉素、链霉素的DMEM/F12培养基稀释）]和姜                       胞，按 5×10 个/孔接种于放有细胞爬片的 6 孔板中，按
                                                                     4
        黄素低、中、高剂量组[25、50、100 μmol/L（以适量DMSO               “2.2”项下方法分组、造模、给药，每组设3个复孔。培养
        溶解后，再以不含血清和青霉素、链霉素的 DMEM/F12                       24 h 后，取出细胞爬片，于 4％多聚甲醛溶液中固定 15
        培养基稀释）；剂量参照本课题组前期预试验结果设                            min，用PBS清洗5 min×3次；用封闭液室温封闭60 min，
        置]。其中，正常对照组细胞不作任何干预，常规培养；                          加入 LC3 一抗（稀释度为 1 ∶ 500），于 4 ℃孵育过夜；用
        损伤模型组细胞经50 μmol/L H2O2诱导培养12 h以复制                  PBST溶液清洗后，加入Alexa Fluor 350标记的IgG二抗
        细胞损伤模型；姜黄素各剂量组经相应浓度药物预处理                           （稀释度为1 ∶ 2 000），室温避光孵育1 h；滴加DAPI荧光
        24 h后，再以50 μmol/L H2O2诱导培养12 h。                    染料，避光孵育5 min；用PBST溶液清洗5 min×4次以除
        2.3  细胞存活率的检测                                      去多余的染料，加入抗荧光猝灭剂适量终止反应。使用
            采用 MTT 法检测。取对数生长期的 H9c2 细胞，按                   荧光显微镜观察并拍照，采用 Image J 1.6.0 软件分析试
        1×10 个/孔接种于 96 孔板中，按“2.2”项下方法分组、造                  验组与正常对照组阳性细胞的相对荧光强度（LC3表达
            4
        模、给药，并另设调零组（只加入不含血清和青霉素、链                          阳性的细胞染色后呈绿色荧光）。上述试验重复6次。


        中国药房    2020年第31卷第23期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 23  ·2865 ·
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