Page 50 - 《中国药房》2020年23期
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中、低剂量组[7.88、3.94、1.97 mg/(kg·d),分别根据人临              闭 30 min 后,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)清洗,滴加
        床用量的 21、14、7 倍剂量换算而得,且前期研究证实高                       Iba-1抗体(稀释度为1 ∶ 1 000),4 ℃下孵育过夜;用PBS
        剂量无明显毒性],每组 20 只。参考文献[9]采用改良线                       清洗 5 min×3 次,滴加 FITC 标记的 IgG 二抗(稀释度为
        栓法建立脑缺血损伤模型:所有大鼠术前禁食不禁水                             1 ∶ 100),避光室温孵育 1 h;用 PBS 清洗 5 min×3 次,用
        12 h,以 10%水合氯醛溶液(0.3 mL/100 g)麻醉后,以仰                DAPI 染料复染细胞核,以抗荧光衰减封片剂避光封
        卧位固定于手术台上,备皮,消毒颈部皮肤;于颈正中切                           片。使用荧光显微镜观察并拍照,模型组和各药物组随
        开,钝性分离并暴露颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)                        机选取缺血半暗带区5个视野,假手术组选取与上述区
        和颈内动脉(ICA),用动脉夹夹闭 CCA 和 ICA,在 CCA                   域对应的 5 个视野,观察 Iba-1 阳性细胞(镜下呈绿色荧
        上作一楔形切口,由此插入线栓(直径0.26 mm),松开动                       光)的表达情况。
        脉夹,将线栓缓慢向 ICA 入颅方向推进,轻推至大脑中                         2.5  大鼠脑缺血半暗带区 Notch-1、TNF-α、ICAM-1 蛋
        动脉起点,遇阻力停止(进线约 18~20 mm),即实现了                       白的表达情况
        大脑中动脉闭塞(MCAO);随后结扎CCA并逐层缝合颈                             采用 Western blotting 法检测。末次给药及神经功
        部切口、消毒。假手术组大鼠同法分离 CCA、ECA、                          能评分结束后,各组另随机选取8只大鼠麻醉后颈椎脱
        ICA,除不插入线栓外,其余操作同上。在手术过程中和                          臼处死,模型组和各药物组选取缺血半暗带区脑组织适
        术后,所有大鼠均被置于恒温[(37.0±0.5)℃]电热板上                      量,假手术组大鼠选择与上述区域对应的脑组织适量,
        保温,待其麻醉清醒后放入饲养笼中,自由摄食饮水。                            按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书方法
        密切观察大鼠生命体征,并根据Longa 5级标准评分法                    [4]  提取总蛋白,上述蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度
        评价其神经行为表现,并将评分为 1~3 分者(假手术组                         后,于 100 ℃下变性 10 min。取变性后的蛋白样品 20
        除外)纳入实验(复制模型过程中如死亡或造模不成功                            μg,进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(分
        则补足,保证每组20只)。于脑缺血2 h后,假手术组和                         离胶:120 V,50 min;5%浓缩胶:80 V,40 min),并于电
        模型组大鼠分别腹腔注射生理盐水1 mL,各给药组大鼠                          泳后转移至PVDF膜上,在4 ℃下用5%脱脂奶粉封闭过
        腹腔注射相应药物1 mL,每日1次,连续给药7 d。                          夜;加入 Notch-1、TNF-α、ICAM-1 抗体和内参β-actin 抗
        2.2  大鼠神经功能评分                                       体(稀释度均为 1 ∶ 1 000),于 4 ℃下孵育过夜;用 PBST
            于末次给药后,采用 Longa 5 级标准评分法对全部                     溶液洗涤 3 次后,加入 HRP 标记的 IgG 二抗(稀释度为
        大鼠进行神经功能评估,评分标准 ——0 分:无任何神                          1 ∶ 10 000),室温下孵育1 h;用PBST溶液洗涤3次后,以
                                      [4]
        经功能缺损的表现,即正常;1分:垂直提起大鼠时,其未                          ECL 法显色,使用全自动化学发光分析仪成像。使用
        能充分伸展前肢;2 分:大鼠行走时身体向一侧倾斜,转                          Image J V1.8.0.112软件分析各条带的灰度值,以目的条
        大圈;3分:大鼠行走时身体向一侧跌倒,转小圈;4分:大                         带 与 内 参 条 带 的 灰 度 值 之 比 表 示 Notch-1、TNF-α 、
        鼠没有运动或自发行走,意识水平低落。                                  ICAM-1蛋白的相对表达水平。
        2.3  大鼠脑组织梗死情况                                      2.6  统计学方法
            采用 TTC 染色法检测。末次给药及神经功能评分                            采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资
        后,各组随机选取6只大鼠麻醉后颈椎脱臼处死,用生理                           料以 x±s 表示,多组间比较采用方差分析,组间两两比
        盐水进行心内灌注并断头取脑。于离额极2 mm处向后                           较用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
        连续等距切取5个冠状切片(厚度约为20 μm),在37 ℃                       3 结果
        条件下置于 2%TTC 染色液中避光染色 30 min,再在                      3.1  大黄酚对脑缺血模型大鼠神经功能缺损评分和脑
        4 ℃条件下置于4%多聚甲醛溶液中固定2 h后,使用相                         梗死面积百分比的影响
        机拍摄(正常脑组织显示为红色,而脑梗死灶显示为白                                假手术组大鼠脑组织未见梗死区域;模型组大鼠脑
        色)。由 Image Pro plus 6.0 图像处理软件分析图像并计                组织梗死区域明显,其神经功能评分和脑梗死面积百分
        算脑梗死面积百分比:脑梗死面积百分比=(对侧半球                            比均较假手术组显著升高(P<0.05);大黄酚各剂量组
        面积-同侧半球非梗死面积)/对侧半球面积×100%。                          大鼠脑组织梗死区域均有所缩小,其神经功能损伤评分
        2.4 大鼠脑缺血半暗带区Iba-1阳性细胞的表达情况                         和脑梗死面积百分比均较模型组显著降低(P<0.01),
            采用免疫荧光染色法检测。取“2.3”项下各组大鼠                        详见表 1、图 1(每组随机展示了 3 只大鼠的 TTC 染色观
        的脑组织切片,置于65 ℃恒温烘箱中烤片1 h,经二甲苯                        察结果)。
        脱蜡、乙醇水化后,用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲溶液进行                      3.2  大黄酚对脑缺血模型大鼠半暗带区 Iba-1 表达的
        抗原修复,再用 3%H2O2溶液在室温下孵育 10 min 以消                    影响
        除内源性过氧化物酶。将切片置于 10%山羊血清中封                               假手术组大鼠脑缺血半暗带区 Iba-1 阳性细胞较


        ·2860 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 23                                 中国药房    2020年第31卷第23期
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