Page 39 - 《中国药房》2020年23期
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度55％～75％，温度20～25 ℃），饲养至8月龄时开始用                     烯酰胺凝胶电泳，再在室温、电流 180 mA 条件下转膜
        于实验。本研究已通过右江民族医学院伦理委员会的                            60 min至硝酸纤维素（NC）膜上；将NC膜置于1×蛋白快
        审批，实验过程中对动物的处置均满足科学技术部颁发                           速封闭液（5×蛋白快速封闭液加水稀释即得）中，摇床上
        的《关于善待实验动物的指导性意见》和《实验动物管理                          振摇封闭15 min；以TBST缓冲液洗膜10 min×3次，然后
        条例》要求。                                             分别加入 Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白（Thr205、Ser404 位
        2 方法                                               点）抗体（稀释比例均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以
        2.1 分组与给药                                          TBST 缓冲液清洗 10 min×3 次，加入 HRP 标记的二抗
            将36只3×Tg-AD小鼠采用随机数字生成法分为模                      （稀释比例为 1 ∶ 5 000），4 ℃下避光振摇 1 h；再次以
        型组、阳性对照组（石杉碱甲，0.15 mg/kg）和TSG低、中、                  TBST 缓冲液清洗 10 min×3 次，加入超灵敏感化学发光
        高 剂 量 组（0.033、0.1、0.3 g/kg），每 组 6 只 ；再 另 取         液，再利用全自动化学发光图像分析仪对蛋白条带拍
        C57BL/6J 小鼠 6 只作为正常对照组。各给药组小鼠灌                     照。采用Image J 1.8.0软件测定条带灰度值。以Tau蛋
        胃相应药物（以水为溶剂对TSG和石杉碱甲进行溶解），                         白为参照，计算磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位点）条
        模型组、正常对照组小鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃体                           带与参照蛋白条带灰度值的比值来表示磷酸化Tau蛋白
        积均为10 mL/kg，每天给药1次，连续给药60 d。TSG及                   （Thr205、Ser404位点）的表达水平。
        石杉碱甲的给药剂量和给药方式均参考本课题组前期                            2.4 统计学方法
                  [9]
        已发表文献 设置。                                              采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计量资
        2.2  小鼠脑组织中Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白（Thr205、                  料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，当方
        Ser404位点）的分布与表达情况检测                                差齐时组间两两比较采用 LSD-t 检验，方差不齐时组间
            采用免疫荧光染色法进行检测。末次给药24 h后，                       两两比较采用Tamhane’s T2检验。P＜0.05表示差异具
        每组取3只小鼠，颈椎脱臼处死，冰上操作取出其完整大                          有统计学意义。
        脑，用冰冻组织包埋剂将大脑组织完整包埋，然后即刻                           3 结果
        缓慢放入液氮中快速固定，随后将固定的脑组织标本转                           3.1 小鼠脑组织中Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白（Thr205、
        移到－80 ℃冰箱保存。临检时，取出冰冻脑组织标本，                         Ser404位点）的分布与表达情况
        连续切片（厚度约为 6 μm）后，将切片转移至－20 ℃的                          与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中Tau蛋白、
        甲醇溶剂中通透 10 min，再用磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡                     磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位点）的表达显著增多、
        5 min×2次，最后在BSA中封闭40 min。加入Tau蛋白、                  容易聚集成团、分布更为广泛，蛋白相对表达量显著升
        磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位点）抗体（稀释比例均                  高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和TSG各剂量
        为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用 PBS 浸泡 5 min× 2 次，加         给 药 组 小 鼠 脑 组 织 中 Tau 蛋 白 、磷 酸 化 Tau 蛋 白
        入同时含有Alexa Fluor 594标记的荧光二抗和荧光染料                   （Thr205、Ser404 位点）的表达和聚集均显著减少、分布
        DAPI（稀释比例均为 1 ∶ 1 000）的混合液，室温孵育 1 h；               范围变窄，蛋白相对表达量均显著降低（P＜0.01）；与阳
        用 PBS 浸泡 5 min×2 次，最后加入荧光猝灭剂封片。在                   性对照组比较，TSG 各剂量给药组小鼠脑组织中 Tau 蛋
        倒置荧光显微镜下观察各组小鼠脑组织中Tau蛋白和磷                          白、磷酸化Tau蛋白（Thr205、Ser404位点）表达的分布差
        酸化 Tau 蛋白（Thr205、Ser404 位点）的分布，并进行拍                别不大，相对表达量差异亦无统计学意义（P＞0.05）。
        照。使用 Image-Pro Plus 6.0 软件测定目标蛋白的平均                各组小鼠脑组织中 Tau 蛋白、磷酸化 Tau 蛋白（Thr205、
        光密度值，来表示各蛋白的相对表达量。                                 Ser404 位点）表达的免疫荧光染色显微图见图 1（图中
        2.3  小鼠脑组织中磷酸化 Tau 蛋白（Thr205、Ser404 位              Tau、Thr205、Ser404 分别表示相应目标蛋白，DAPI 表示
        点）的表达水平检测                                          细胞核，Merge 表示目标蛋白在细胞核相同位置的表达
            采用Western blotting法进行检测。取各组剩余的3                分布）；相对表达量测定结果见表1。
        只小鼠，颈椎脱臼处死，冰上操作取出完整大脑并保存                           3.2  小鼠脑组织中磷酸化 Tau 蛋白（Thr205、Ser404 位
        于液氮中。利用液氮研磨脑组织，然后按每200 mg脑组                        点）表达水平测定结果
        织加入2 mL蛋白混合裂解液[RIPA高效快速裂解液-磷                           与正常对照组比较，模型组小鼠脑组织中磷酸化
        酸蛋白酶抑制剂-PMSF（100 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）]，于冰上充分             Tau 蛋白（Thr205、Ser404 位点）表达水平显著升高（P＜
        裂解30 min后，在4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，收集             0.01）；与模型组比较，阳性对照组和TSG各剂量组小鼠
        上清，采用 BCA 法测定上清液中总蛋白浓度。用 5×蛋                       脑组织中磷酸化 Tau 蛋白（Thr205、Ser404 位点）的表达
        白上样缓冲液稀释所得蛋白溶液，于95～100 ℃沸水中                        水平均显著降低（P＜0.01）；与阳性对照组比较，TSG
        变性6 min后保存于－20 ℃冰箱中。临检时，取变性蛋                       中、高剂量组小鼠脑组织中磷酸化 Tau 蛋白（Thr205 位
        白，按每孔 80 μg 蛋白的量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙                      点）以及TSG各剂量给药组小鼠脑组织中磷酸化Tau蛋


        中国药房    2020年第31卷第23期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 23  ·2849 ·
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