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肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension，PAH）     试剂盒（批号：11781200）、RIPA 裂解液（批号：89901）、
        是我国临床常见的重大疾病之一，具有较高的致死、致                           疏水化试剂Surfasil（批号：TS-42800）、Ⅰ型胶原蛋白（批
        残率  [1-3] 。随着人们生活水平的提高，PAH的风险因素也                   号：A1048301）、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化液
        日益增加    [4-6] ，给患者家庭和社会带来严重的经济负担。                  （批号：R001100）均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公
        PAH 发病机制复杂，从分子病理学角度看，其是由肺动                         司；CCK-8 试剂盒（日本 Dojindo 公司，批号：CK04）；
        脉平滑肌细胞（Pulmonary artery smooth muscle cells，       RNeasy Mini Kit（德国 Qiagen 公司，批号：74104）；兔源
        PASMCs）异常增殖和迁移导致肺动脉重建所引起的，目                        CTGF（批号：ab6992）、AREG（批号：ab180722）、β-肌动
        前尚未开发针对其分子病理进展的有效药物，可见研究                           蛋白（β-actin，批号：ab8227）多克隆抗体和辣根过氧化物
        PAH 的疾病分子机制并开发有效的治疗方法是生物医                          酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批
        药领域的重要工作。                                          号：ab7090）、BCA 蛋白检测试剂盒（批号：ab102536）以
            肺动脉重建是PAH的重要过程，PASMCs可通过异                      及 ECL 显色液（批号：ab133406）均购自英国 Abcam 公
        常增殖、迁移等方式诱导肺动脉重建，导致肺动脉硬化                           司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
       （Arterial stiffness，AS）和 PAH，进而使患者产生劳力性             相关试剂[生工生物工程（上海）股份有限公司]；细胞培
        呼吸困难、严重供氧不足等症状，最终可导致其心力衰                           养板（美国 Corning 公司）；引物由生工生物工程（上海）
        竭，甚至死亡     [7-9] 。可见，阻止肺动脉重建是治疗PAH的                股份公司设计、合成；其余试剂均为分析纯，水为灭菌超
        潜在途径，干预 PASMCs 异常的增殖、迁移是阻止肺动                       纯水。
        脉重建的有效手段。若能成功干预 PASMCs 的异常增                        1.3 细胞系
                                                                                                         TM
        殖和迁移，将有可能阻止肺动脉重建和患者劳力性呼吸                               人原代 PASMCs 系（编号：ATCC PCS-100-023 ）
                                                                                            ®
        困难、严重供氧不足等症状恶化，还有可能达到治疗                            购自美国ATCC公司。
        PAH的目的。                                            2 方法
            已有研究证明，Hippo/YAP 信号通路在 PASMCs 中                2.1  AS细胞模型的建立
        异常激活，从而增强了细胞的增殖、迁移能力，是肺动脉                          2.1.1  凝胶包被培养板的制备            首先将一个 15 mm 玻
        重建的主要因素之一。因此，Hippo/YAP 信号通路为抑                      璃盖玻片硅烷化，再在一个玻璃板上制备疏水面。配制
                                       [10]
        制肺动脉重建的主要治疗靶点之一 。尼可地尔是治                            含 0.075％过硫酸铵、0.015％焦亚硫酸钠、0.15％四甲基
                         [11]
        疗 PAH 的传统用药 ，但该药是否具有抑制 Hippo/YAP                   乙二胺的水溶液，并按12∶0.24（V/V）与丙烯酰胺-双丙烯
        信号通路等分子生物学功效仍少有研究。基于此，笔者                           酰胺溶液（7.5 ∶ 0.24，V/V）混合，制备成凝胶。将该凝胶
        研究了尼可地尔对 PASMCs 增殖、迁移能力和 Hippo/                    覆盖于玻璃板的疏水面上，再以盖玻片的烷基化面覆
        YAP 信号通路中结缔组织生长因子（CTGF）、双向调节                       盖，组合成上、中、下层分别为硅烷化盖玻片、凝胶、疏水
        蛋白（AREG）的影响，旨在为阐明药物作用机制以及寻                         玻璃板的“三明治”结构。待该“三明治”结构凝固后小
        找PAH新治疗策略提供理论基础。                                   心剥离盖玻片和凝胶，弃去玻璃板，将盖玻片和凝胶置
        1 材料                                               于培养板上，微波灭菌，用 PBS 清洗后，用 0.05 mg/mL
        1.1  仪器                                            Ⅰ型胶原蛋白覆盖培养板孔底部，室温孵育 20 min，活
            BB15 型细胞培养箱、Invitrogen E-Gel Imager 型凝         化后用PBS清洗即得可接种细胞的凝胶包被培养板。
        胶成像系统、Multiskan Sky 型全波长酶标仪（美国 Ther-               2.1.2  建模    根据 Dieffenbach P 等 于 2017 年发表的
                                                                                          [10]
        mo Fisher Scientific公司）；5702型低速离心机、5425R型          文献方法，以“2.1.1”项下所得凝胶包被的培养板为载
        高速离心机（德国 Eppendorf 公司）；7500 Fast 型实时聚              体，通过将人原代PASMCs 接种于凝胶上，于37 ℃、5％
        合酶链式反应（PCR）系统（美国ABI公司）；DMil型显微                     CO2的培养箱中培养12 h，待细胞贴壁，以此模拟PAH环
        镜（德国Leica公司）。                                      境，获得AS细胞模型。
        1.2 药品与试剂                                          2.2 分组与给药
            尼可地尔对照品（美国Sigma公司，批号：N3539，纯                       将人原代PASMCs分为5组，分别为正常对照组、模
        度：≥98％）；磷酸盐缓冲液（PBS，批号：70011069，pH                  型组和尼可地尔低、中、高浓度组，每组设3个复孔。正
        7.4）、DMEM 培养基（批号：12491015）、胎牛血清（FBS，               常对照组细胞按1×10 个/孔接种于24孔培养板上，每孔
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        批号：16000044）、Super Script Ⅱ阴性逆转录酶（批号：              含 20％FBS 的 DMEM 培养基 600 μL，待培养 12～24 h
        18064002）、荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测                   至贴壁后，采用同等体积溶剂（生理盐水）处理。后4组


        中国药房    2020年第31卷第22期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 22  ·2737 ·
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