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后，以 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，每孔 100 μL。将细 料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
4
胞随机分为空白组、模型组（H/R组）、H/R+药物组（给药 两两比较采用 LSD 检验。以 P＜0.05 为差异有统计学
浓度参考“2.4”项下结果，下同），每组设置3个复孔。空 意义。
白组不作任何处理；H/R 组、H/R+药物组先参照“2.3”项 3 结果
下方法建立H/R损伤模型，药物组再给予相应药物。培 3.1 当归挥发油对H9C2细胞活力的影响
养适宜时间（时间参考“2.4”项下结果，下同）后，收集各 与空白组比较，不同浓度当归挥发油组细胞在培养
组细胞上清液。参照相应试剂盒说明书，采用多功能酶 2、4、6 h 后的相对活力均无显著变化（P＞0.05），且在一
标仪于450 nm波长处检测并计算LDH活性。LDH活性 定程度上有随浓度增加而升高的趋势，并在当归挥发油
越高，则细胞自噬水平越高 。上述试验重复3次。 60 μmol/L时达到最高值；且随处理时间的延长，这一作
[5]
2.6 当归挥发油对H9C2细胞自噬水平的影响 用越发明显，其中以60 μmol/L当归挥发油培养6 h时的
采用MDC法检测。取对数生长期的H9C2细胞，按 细胞相对活力最高，故本研究选取上述条件进行后续试
“2.4”项下方法制备细胞悬液后，以5×10 个/孔接种于96 验。不同浓度当归挥发油对H9C2细胞相对活力的影响
3
孔板中，每孔 100 μL。将细胞随机分为空白组、模型组 见图1。
（H/R组）、H/R+药物组（终浓度同“2.5”项）、H/R+自噬抑 150
[16]
制剂组（3-MA终浓度为5 mmol/L ）。空白组不作任何 2 h
处理；H/R 组、H/R+药物组、H/R+自噬抑制剂组先参照 4 h
“2.3”项下方法建立H/R损伤模型，各药物组再给予相应 ％ 100 6 h
药物。培养适宜时间后，以无菌PBS轻柔清洗2次，洗去 细胞相对活力，
药物和抑制剂后，每孔加入MDC染色工作液100 μL，于 50
37 ℃、5％CO2条件下避光孵育 15～60 min；然后，各孔
加入PBS 100 μL清洗2～3次后，置于荧光显微镜下，观
察 MDC 染色情况，随机选取 3 个视野进行拍照，使用 0
0 20 40 60 80 100
Iamge-Pro Plus 6.0 图像处理软件分析染色部位的积分 浓度，μmol/L
光密度（IOD）并计算 MDC 平均荧光强度。平均荧光强 图1 不同浓度当归挥发油对H9C2细胞相对活力的影
度值越高，则细胞自噬水平越高 。上述试验重复3次。 响（x±±s，n＝3）
[6]
2.7 当归挥发油对 H9C2 细胞中 Beclin-1、LC3ⅡⅡ、LC3 Fig 1 Effects of different concentration of volatile oil
Ⅰ、p62蛋白表达的影响
Ⅰ from A. sinensis on relative activity of H9C2
采用 Western blotting 法检测。取对数生长期的 cells（x±±s，n＝3）
H9C2细胞，参照“2.6”项下方法接种、分组、造模、给药，
3.2 当归挥发油对 H9C2 细胞上清液中 LDH 活性的
培养适宜时间后，弃去培养液，用PBS 轻柔清洗1～2次
影响
后，加入 RIPA 裂解液 200 μL 和苯甲基磺酰氟（PMSF）2
与空白组比较，H/R组细胞上清液中LDH活性显著
μL，并进行冰上裂解。细胞充分裂解后，于 4 ℃下以
升高（P＜0.05）；与H/R组比较，H/R+药物组细胞上清液
12 000 r/min 离心 20 min，取上层总蛋白提取液，采用
中 LDH 活性显著降低（P＜0.05）。当归挥发油对 H9C2
BCA法进行蛋白定量。取蛋白适量，在100 ℃下行变性
细胞上清液中LDH活性的影响见图2。
处理后，进行 15％ SDS-PAGE，随后转移至聚偏二氟乙
400
烯膜（PVDF）上，以 7％脱脂奶粉于室温下封闭 1 h；用
＊
TBST溶液清洗10 min×3次，然后加入自噬相关蛋白Be- 300
clin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62抗体和内参β-actin抗体（稀释 U/L
度均为 1 ∶ 500），4 ℃孵育过夜；以 TBST 溶液清洗 10 LDH 活性， 200
min×3次，加入二抗（稀释度为1 ∶ 500），室温孵育2 h；以 100 #
TBST 溶液清洗 10 min×3 次，滴加 ECL 显影液，在化学
发光成像系统中曝光成像，采用 Image J 1.8.0 图像处理 0
空白组 H/R组 HR+药物组
软件测量各目标蛋白灰度值，并以内参蛋白灰度值为参 注：与空白组比较，P＜0.05；与H/R组比较，P＜0.05
＊
#
照计算相对灰度值以表示目标蛋白（Beclin-1、p62）的表 Note：vs. blank group，P＜0.05；vs. H/R group，P＜0.05
＊
#
达水平，同时计算 LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的灰度值比值（以下简 图2 当归挥发油对H9C2细胞上清液中LDH活性的影
称“LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值”）。上述试验重复3次。 响（x±±s，n＝3）
2.8 统计学方法 Fig 2 Effects of volatile oil from A. sinensis on activity
采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资 of LDH in H9C2 cell supernatant（x±±s，n＝3）

·2494 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 20 中国药房 2020年第31卷第20期