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何有效改善I/R所致组织损伤成为了学者研究的热点。                          克 隆 抗 体（批 号 ：WL02385）、RIPA 裂 解 液（批 号 ：
            导致心肌 I/R 损伤的机制较复杂，而自噬在组织损                      WLA014）均购自沈阳万类生物科技有限公司；兔源微管
        伤中扮演了重要的角色。有研究表明，自噬可降解老化                           相关蛋白轻链 3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ多克隆抗体（美国 Pro-
        的蛋白质及受损的细胞器，在维持心脏的正常形态和功                           teintech 公司，批号：14600-1-AP）；厌氧产气包和厌氧培
                                                  [5]
        能以及改善心肌 I/R 损伤等方面发挥了积极作用 。但                        养袋均购自青岛海博生物技术有限公司；其余试剂均为
        是，自噬对细胞的作用是双向的，过度自噬也可以造成                           分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水（三级）。
                [6]
        组织损伤 。有研究发现，中药能有效缩小I/R后组织的                         1.3 细胞
        坏死面积，并能改善相应脏器的功能障碍，其治疗机制                               大鼠心肌H9C2细胞购自武汉博士德生物工程有限
                                  [7]
        可能与对自噬作用的调控有关 。                                    公司。
            中药当归以补血通络为主要功效，常用于胸痹等缺                         2 方法
        血性疾病的治疗，而挥发油是当归的主要活性成分之                            2.1 药物工作液制备
        一。已有文献报道，当归挥发油可对大鼠局灶性脑 I/R                             取当归挥发油1 g，加适量DMSO溶解后，以DMEM
                                      [9]
                        [8]
        损伤发挥保护作用 ，并且对平滑肌 、免疫系统                  [10-12] 及心  无糖培养基配制成质量浓度为 4.28 mmol/L 的母液，
        血管系统    [13-14] 等也有相应的保护作用。但是，当归挥发                 于－20 ℃下保存；临用前，用DMEM无糖培养基稀释至
        油的作用机制是否与自噬有关，目前尚未得到证实。因                           相应质量浓度的工作液。称取 3-MA 适量，以 DMEM/
        此，笔者以当归挥发油预处理大鼠心肌H9C2细胞，以缺                         F12培养基制成浓度为5 mmol/L的工作液，备用。
        氧/复氧（H/R）模拟心肌 I/R 损伤，并选用自噬抑制剂 3-                   2.2 细胞培养
        甲基腺嘌呤（3-MA）作为阳性对照，探讨当归挥发油是                             将H9C2细胞培养于含有10％胎牛血清及1％青链
        否能通过调节自噬对大鼠心肌H9C2细胞的H/R损伤来                         霉素混合液的 DMEM 无糖培养基中，置于 37 ℃、5％
        发挥保护作用，以期为当归挥发油在心肌 I/R 损伤研究                        CO2的细胞培养箱中进行培养。
        领域中的开发和利用提供依据。                                     2.3  H/R损伤细胞模型的建立
        1 材料                                                   参考文献方法 选取缺氧 2 h、复氧 4 h 为模型建立
                                                                            [15]
        1.1  仪器                                            条件：取 H9C2 细胞，复苏，待其生长至培养皿的 80％～
            MCO-15AC 型 CO2细胞培养箱（日本 Sanyo 公司）；              90％时，弃去培养基，以无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH
        BX53T-32F01-FLB3 型 荧 光 显 微 镜（日 本 Olympus 公         7.2）洗涤后，加入不含血清的 DMEM 无糖培养基，置于
        司）；Infinite 200 PRO 型多功能酶标仪（瑞士 Tecan 公             厌氧培养袋中（内有一个打开的厌氧产气包）进行密封
        司）；1708625 型 电 泳 仪 、化 学 发 光 成 像 系 统（美 国            培养 2 h，使细胞缺氧；随后，以不含血清的 DMEM/F12
        Bio-Rad公司）；HS-1800型超净工作台（苏州安泰空气技                   培养基替换 DMEM 无糖培养基，置于 37 ℃、5％CO2的
        术有限公司）。                                            细胞培养箱中继续培养 4 h 进行复氧，以建立 H/R 损伤
        1.2  药品与试剂                                         细胞模型。
            当归挥发油[甘肃康达药业开发有限责任公司，批                         2.4  当归挥发油对H9C2细胞活力的影响
        号：20190916，含量：81.4％（以藁苯内酯计）]；自噬抑制                      采用 CCK-8 法检测。取对数生长期的 H9C2 细胞，
        剂 3-MA 对照品（美国 Targetmol 公司，批号：T1897，纯              用无血清 DMEM/F12 培养基制备细胞悬液，并以 1×10                 4
        度：98％）；胎牛血清（美国 Clark 公司，批号：FB25015）；               个/孔接种于 96 孔板中，每孔 100 μL。将细胞随机分为
        DMEM无糖培养基（批号：90113）、青链霉素混合液（批号：                    空白对照组和不同浓度当归挥发油组，在37 ℃、5％CO2
        P1400）、二甲亚砜（DMSO，批号：D8371）均购自北京索莱                  的细胞培养箱中培养24 h。以无菌PBS洗涤后，除空白
        宝科技有限公司；0.25％蛋白胰酶（批号：SH30031.02）、                  对照组不加药外，其余各组均加入无菌当归挥发油工作
        DMEM/F12 培养基（批号：SH30213.02）均购自美国 Hy-               液（终浓度分别为0、20、40、60、80、100 μmol/L），每组设
        clone公司；增强型CCK-8试剂盒（上海尚宝生物科技有                      置3个复孔。继续培养2、4、6 h后，弃上清液，每孔加入
        限公司，批号：ST1006）；细胞自噬染色（MDC法）检测试                     无血清 DMEM/F12 培养基 100 μL 和 CCK-8 检测试剂
        剂盒（北京雷根生物技术有限公司，批号：DA0041）；乳                       10 μL，继续培养40 min，采用多功能酶标仪在490 nm波
        酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（批号：WLA073）、十二烷                      长处检测各孔的光密度（OD）值并按说明书公式计算各
                                                                                                    [4]
        基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）快速制备                       组的相对细胞活力，OD 值越高，细胞活力越强 。上述
        试剂盒（批号：WLA013）、BCA 蛋白质定量试剂盒（批                      试验重复3次。
        号：WLA004）、超敏 ECL 试剂盒（批号：WLA006）、兔源                 2.5  当归挥发油对 H9C2 细胞上清液中 LDH 活性的
        β-actin 多克隆抗体（批号：WL0002c）、辣根过氧化物酶                  影响
       （HRP）标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗（批号：WLA023a）、                      采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测。取对数
        兔源Beclin-1多克隆抗体（批号：WL02508）、兔源p62多                 生长期的 H9C2 细胞，按“2.4”项下方法制备细胞悬液


        中国药房    2020年第31卷第20期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 20  ·2493 ·
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