Page 90 - 2020年19期
P. 90

血大鼠模型：取110只大鼠进行造模，腹腔注射2％戊巴                          血-脑脊液屏障通透性示踪剂EB于大鼠尾静脉注射。2
        比妥钠以麻醉大鼠，固定，用手术剪剪开大鼠颈部皮肤，                           h 后，脱颈处死大鼠并开颅取脑组织，称定脑组织质量，
        分离颈内、颈外、颈总动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉的                           随后置于含有甲酰胺（1 mL/100 g）的离心管中，37 ℃水
        近心端，夹闭远端颈内动脉，用手术剪在距颈内动脉分                            浴 48 h，以 3 000 r/min 离心 10 min 后，取上清液。使用
        叉1 cm处剪一切口，将头端涂上硅胶的尼龙线自大鼠左                          分光光度计在635 nm波长处，测定上清液的吸光度。以
        侧颈总动脉缓慢插入颈内动脉至线栓到达大脑中动脉                             EB含量（μg/g）为横坐标、吸光度值为纵坐标，绘制EB标
        分叉处（此时有少许阻力），固定线栓，缝合伤口，2 h 后                        准曲线，并以标准曲线计算脑组织中EB含量。EB含量
        以抽回线栓恢复再灌注，大鼠造模完成。建模成功标                             越高，表示大鼠血脑屏障的通透性越大。
        准：进行提尾悬空实验时，即大鼠对侧肢体瘫痪、同侧眼                           2.6 大鼠脑组织的病理学变化观察
        裂减小、向对侧转弯。另取20只大鼠作为假手术组，除不                              末次给药24 h后，各组取剩余5只大鼠，脱颈处死后
        结扎和插线外，其余操作步骤与上述方法相同。造模结                            立刻手术开颅，取出脑组织，一部分保存于－80 ℃的冰
        束后，将造模成功的100只大鼠分为模型组、尼莫地平组                          箱中待用，一部分用 4％多聚甲醛溶液固定 24 h。固定
                  [11]
        （20 mg/kg） 和ICSⅡ低、中、高剂量组（4、8、16 mg/kg） ，            后的脑组织用石蜡包埋，切片，采用 HE 染色后，置于显
                                                      [6]
        每组 20 只。造模 24 h 后，各给药组大鼠每天 9：00 和                   微镜下观察脑组织病理学变化。
        16：00 时灌胃相应药物 1 次，每天 2 次，每次给药体积均                    2.7 大鼠脑组织中miR-141-3p表达水平检测
        为2 mL，连续给药3 d；假手术组和模型组大鼠同法灌胃                            采用荧光定量 PCR（qRT-PCR）法检测。取出“2.6”
        等体积生理盐水。                                            项下冷冻的脑组织适量，采用 RNA 提取试剂盒提总
        2.2 大鼠神经功能缺损评分                                      RNA，再使用反转录试剂盒处理得到cDNA。用qRT-PCR
            在给药第0天（即造模后24 h后、给药前即刻）、给药                      仪测定miR-141-3p表达水平。反应体系（20 µL）：cDNA
                                    [12]
        第 1 天和第 3 天，根据文献方法 对各组大鼠进行神经                        模板1 µL，上游引物0.5 µL，下游引物0.5 µL，H2O 8 µL，
        功能缺损评分：从前肢对称外展（对称伸展3分、轻度不                           2×Mix 10 µL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性
        对称伸展2分、显著不对称伸展1分、偏瘫0分）、体态对                          10 s、62 ℃退火 30 s，78 ℃延伸 30 s，45 个循环；72 ℃再
        称运动（对称运动 3 分、轻度不对称运动 2 分、显著不对                       延伸 5 min。用 2   －ΔΔCt 法对 miR-141-3p 表达水平进行定
        称运动1分、偏瘫0分）、两侧身体触觉反射（双侧对称反                          量分析。使用在线软件Primer 5.0设计所得qRT-PCR所
        应3分、一侧反应迟钝2分、一侧无反应1分）、自主活动                          需 引 物 ，其 中 miR-141-3p 上 游 引 物 序 列 为 5′-TAA-
        （活动正常3分、轻度影响2分、重度影响1分、无自主运                          CACTGTCTGGTAAAGATGG-3′，下游引物序列为 5′-
        动0分）、触须对钝棒触及的反应（对称反应3分、不对称                          ATCTTTACCAGACAGTGTTATT-3′，引 物 长 度 为 60
        反应2分、一侧无反应1分）、攀爬（攀爬容易及抓持有力                          bp；内参 U6 上游引物序列为 5′-ATTGGAACGATACA-
        3分、一侧损害表现2分、不能攀爬或转圈1分）等6个方                          GAGAAGATT-3′，下游引物序列为 5′-GGAACGCTT-
        面评估大鼠神经功能损伤的程度，总分值为3～18分，得                          CACGAATTTG-3′，引物长度为100 bp。
        分越高说明其神经功能损伤越小。                                     2.8  大鼠脑组织中 Notch-1、Nrf2 蛋白相对表达水平
        2.3  大鼠脑梗死体积测定                                      检测
            末次给药24 h后，各组随机选取5只大鼠，脱颈处死                           采用 Western blotting 法检测。取出“2.6”项下冷冻
        后取出脑组织，置于－20 ℃冰箱中冷冻30 min后切片，                       的脑组织适量，加入 RIPA 蛋白裂解液，研磨均匀，以 3
        避光条件下放入含有 TTC 染色液的棕色瓶中，于 37 ℃                       000 r/min离心10 min后，取上清液，采用BCA法测定蛋
        下染色 30 min；染色后置于 4％多聚甲醛溶液中固定 24                     白水平。蛋白煮沸变性后，取20 µg，以十二烷基硫酸钠-
        h，以滤纸吸干后，置于显微镜下观察。镜下可见大鼠脑                           聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，湿法转膜，以
        组织正常区域呈红色，梗死区域呈苍白色。采用 Image                         5％ BSA 封闭结合位点，再分别加入 Notch-1、Nrf2、β-
        Pro Plus 6.0软件计算各组大鼠脑组织的梗死体积。                       actin一抗（1 ∶ 2 000），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的羊
        2.4 大鼠脑组织含水量测定                                      抗兔 IgG 二抗（1 ∶ 5 000），37 ℃孵育 1 h，使用 ECL 蛋白
            末次给药24 h后，各组随机选取5只大鼠，脱颈处死                       显色试剂盒曝光显色后，于凝胶成像分析系统中观察拍
        后立刻手术开颅，取出脑组织，以滤纸吸干表面血迹，称                           照。使用软件Image Lab 5.1分析各蛋白条带灰度值，以
        定脑湿质量（W）；随后将脑组织置于 80 ℃烘箱中，烘干                        β-actin为内参对照计算目标蛋白的相对灰度值，来表示
        至恒质量，称定其干质量（D）。根据公式计算大鼠脑组                           其表达水平。
        织含水量：脑组织含水量（％）＝（W－D）/W×100％。                        2.9 统计学方法
        2.5  大鼠血脑屏障通透性测定                                        采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析。计量资
            末次给药24 h后，各组随机选取5只大鼠，采用2％                       料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间


        ·2388 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19                                 中国药房    2020年第31卷第19期
   85   86   87   88   89   90   91   92   93   94   95