Page 80 - 2020年19期

2.3 细胞划痕试验检测细胞迁移能力
将细胞按“2.2”项下方法消化、离心、收集并重悬，制
5
备成密度为1×10 个/mL的细胞悬液，按2 mL/孔的量接
种至 6 孔板。将细胞分为空白对照组（含 0.4％DMSO）
和不同浓度五味子甲素组（10、20、40 μmol/L，含 0.4％
DMSO），每组设置3个复孔。将细胞置于37 ℃、5％CO2
的培养箱中培养，待细胞生长融合达 95％以上时，用
200 μL移液枪头在每个孔中的单层细胞上划线，然后以
PBS 洗涤 2 次后，各孔加入相应药物，继续培养 0、24 h
后，于倒置显微镜下观察。随机选取5个视野进行拍照，
使用 Image Pro Plus 6.0 软件测量划痕面积，并根据 0 h
与 24 h 时的划痕面积差值计算细胞的迁移率[迁移率
（％）＝（给药 0 h 时的划痕面积－给药 24 h 时的划痕面
积）/给药0 h时的划痕面积×100％]。试验重复3次。
2.4 Transwell小室试验检测细胞侵袭能力
将 Matrigel 胶和无血清 DMEM 高糖培养基按 1 ∶ 8
的体积比混匀，铺于Transwell上室，并置于37 ℃培养箱
中烘干，弃掉多余的培养基。将细胞按“2.2”项下方法消
5
化、离心、收集并重悬，制备成密度为2×10 个/mL的细胞
悬液，用移液枪分别吸取200 μL加入到Transwell上室，
再分别加入0（空白对照）、10、20、40 μmol/L的五味子甲
素（均含0.4％DMSO），每个浓度设置3个样本。在下室
中加入700 μL含10％FBS的DMEM高糖培养基。培养
24 h后，使用4％多聚甲醛固定小室，用PBS漂洗2次，然
后用0.1％结晶紫染色15 min。擦拭掉非侵袭细胞后，在
倒置显微镜下观察，计数每孔转移至微孔膜下层的细胞
数，每个样本随机选择5个视野进行计数。试验重复3次。
2.5 计算机分子对接分析五味子甲素与 Met 蛋白的结
合能力
从在线数据库 PubChem Compound（https：//www.
ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）中下载五味子甲素的三
维结构文件（SDF 格式）。从在线数据库 Protein Data
Bank（PDB，https：//www.rcsb.org/）中下载 Met 蛋白的晶
体 结 构 文 件（该 蛋 白 在 PDB 数 据 库 的 检 索 ID 号 ：
3DKF）。将Met蛋白的晶体结构文件导入到SYBYL 1.3
软件中，删除原配体、修复氨基端和羧基端的黏性末端
后，以自动识别模式根据蛋白序列鉴定蛋白的活性口
袋；再导入五味子甲素的三维结构文件，以柔性对接模
式进行对接。根据结合评分（C-score：0～5）判断分子与
蛋白活性口袋结合的稳定性，C-score 在 4～5 分范围则
可认为分子与蛋白能够稳定结合 。
[11]
2.6 Western blotting 法检测细胞中 Met/PI3K/Akt 信
号通路相关蛋白的表达情况
将细胞按“2.2”项下方法消化、离心、收集并重悬，制
·2378 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 19
备成密度为1×10 个/mL的细胞悬液，按2 mL/孔接种至
5
6 孔板。将细胞置于 37 ℃、5％CO2培养箱内培养，待细
胞贴壁后，分别加入 0（空白对照）、10、20、40 μmol/L 的
五味子甲素（均含0.4％DMSO）培养24 h。培养结束后，
吸弃培养基，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂混
合液（体积比为100 ∶ 1），在冰上裂解细胞15 min，然后在
4 ℃下以 12 000 r/min 离心 30 min，吸取蛋白上清液，用
BCA 法进行蛋白定量。蛋白经变性处理后，取 25 μg 经
10％SDS-PAGE 在 90 V 恒定电压下电泳 2 h，300 mA 恒
流 2 h 转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以 5％脱脂牛奶室
温封闭 2 h；分别加入 Met、p-Met、PI3K、p-PI3K、Akt、
p-Akt、Bcl-2、N-cadherin 和 GAPDH 一抗（稀释比例均为
1∶1 000），在4 ℃下孵育过夜；TBST漂洗5 min×3次，加入
山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗（稀释比例均为1∶2 000），
在室温摇床中孵育2 h；TBST漂洗5 min×3次，滴加ECL
高敏曝光液，于 Bio-Rad 成像仪中进行显影。以 Image
Lab 5.2.1 软件测定条带的灰度值后，p-Met 以 Met 为内
参，p-PI3K以PI3K为内参，p-Akt以Akt为内参，Bcl-2和
N-cadherin以GAPDH为内参，计算目标蛋白条带与内参
蛋白条带灰度值的比值以表示目标蛋白的相对表达
量。试验重复3次。
2.7 统计学分析
采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。试验数据以
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 五味子甲素对HONE-1细胞增殖的影响
与空白对照（0 μmol/L）比较，10、20、40 μmol/L五味
子甲素处理 24、48 h 后细胞的增殖率均显著降低（P＜
0.05 或 P＜0.01），且具有一定的浓度依赖性趋势，提示
五味子甲素能够显著抑制 HONE-1 细胞的增殖。不同
浓度五味子甲素作用24、48 h后细胞增殖率测定结果见
表1。
表 1 不同浓度五味子甲素作用 24、48 h 后细胞增殖率
测定结果（x±±s，n＝3）
Tab 1 Cell proliferation rate of cells after 24，48 h of
treatment with different concentrations of de-
oxyschizandrin（x±±s，n＝3）
五味子甲素浓度，μmol/L 细胞增殖率，％
作用24 h 作用48 h
0（空白对照） 100.0±2.5 100.0±1.3
10 90.3±1.7 ＊ 81.3±2.1 ＊
20 84.7±4.2 ＊ 71.4±2.5 ＊＊
40 79.3±2.2 ＊＊ 50.1±1.7 ＊＊
注：与空白对照比较，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
Note：vs. blank control，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
中国药房 2020年第31卷第19期