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再按“2.2”项下方法计算 LP 提取率。结果，随着醇沉浓                      度（IC50）。抑制率＝[OD 空白对照－（OD 检测样品－OD 检测背景）/
        度的提高，LP 提取率也随之升高；当醇沉至 80％时，再                       OD 空白对照]×100％。结果，LP 的 IC50为 0.056 mg/mL，阿卡
        提高醇沉浓度，LP 提取率基本没有变化详见图 3B。故                        波糖（阳性对照）的IC50为0.196 mg/mL，详见表4。
        为了节约溶剂，本研究最终选择醇沉至含醇量的80％。                          表 4 LP 和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制作用的检测
        2.5 Sevage除蛋白                                            结果（x±±s，n＝3）
                        [20]
            参照刘子健等 报道的除蛋白方法，取荔枝核药材                         Tab 4 Detection results of inhibitory effects of LP and
        适量，按“2.3”“2.4”项下最优条件水提醇沉后，干燥至恒                            acarbose on α-glucosidase（x±±s，n＝3）
        定质量，用水稀释制成质量浓度为 5 mg/mL 的水溶液，                      待测物            质量浓度，mg/mL     抑制率，％      IC50，mg/mL
                                                           阿卡波糖（阳性对照）        1           74.11±2.83  0.196
        与 Sevage 试剂（氯仿-正丁醇＝4 ∶ 1，V/V）混合（LP 水溶
                                                                             0.5         69.03±2.18
        液 -Sevage 试 剂 ＝5 ∶ 1，V/V），振 荡 ，静 置 ，回 收 下 层                          0.25        55.82±2.66
        Sevage试剂，将剩余的药液和析出物以5 000 r/min离心                                    0.1         48.80±2.21
                                                                             0.01        34.23±2.98
        10 min，再加入上清液体积1/5的Sevage试剂，重复上述
                                                           LP                1           88.82±2.01  0.056
        操作3次，收集上清液，冻干，即得除蛋白后的粗多糖。                                            0.5         78.33±2.89
        2.6 工艺验证                                                             0.25        62.71±2.10
                                                                             0.1         50.65±2.99
            取荔枝核药材 1 000 g，共 3 份，按“2.3”项下最优工                                 0.01        42.36±2.12
        艺用水提取，将水提液浓缩至原体积的 40％后，用乙醇                         3 讨论
        进行80％醇沉，再按“2.5”项下方法除蛋白后，按“2.1.2”                       本研究采用响应面法优化了LP的水提工艺。响应
        项下方法制备供试品溶液，再按“2.2”项下方法计算 LP                       面法是工艺优化的常用方法之一，相比于传统的正交设
        提 取 率 。 结 果 ，3 次 验 证 试 验 的 LP 提 取 率 分 别 为          计，前者得到的回归方程精度更高，并可评价各因素的
        7.61％、7.89％、7.99％，平均提取率为 7.83％（RSD＝                交互作用 。为此，本研究采用响应面法，以料液比、提
                                                                    [21]
        2.52％，n＝3）；3 次验证试验的 LP 含量分别为 55.57％、               取时间、提取次数为考察因素，以 LP 提取率为评价指
        55.83％、56.66％，平均含量为 56.02％（RSD＝1.81％，              标，对LP水提工艺进行优化。结果显示，响应面试验所
        n＝3），提示该工艺稳定、可行。                                   得回归方程模型拟合良好。在所选的各因素水平范围
        2.7  LP对α-葡萄糖苷酶的抑制活性                               内，提取时间对LP提取率的影响最大，提取次数的影响
            采用PNPG法进行考察。                                   次之，料液比的影响最小；料液比、提取时间和提取次数
        2.7.1  溶液的制备 （1）磷酸盐缓冲溶液（PBS）：取一定                   有显著的交互作用。优化后的最优LP水提取条件为料
        量磷酸氢二钾、磷酸二氢钾，用水制成 pH 为 6.8 的缓冲                     液比 1 ∶ 19（g/mL）、提取时间 1 h、提取 3 次，预测多糖提
        溶液。（2）样品测定溶液：取一定量粗多糖固体粉末，用                         取率为 7.57％。水提取工艺的 3 次验证试验结果显示，
        PBS制成质量浓度分别为 1.0、0.5、0.25、0.1、0.01 mg/mL           平均LP提取率为7.61％，与预测值接近，提示该水提取
        的溶液（以葡萄糖计）。（3）阳性测定溶液：取一定量阿卡                        工艺可行。
        波糖，用 PBS 制成质量浓度分别为 1.0、0.5、0.25、0.1、                   本研究进一步采用单因素试验法考察了LP的醇沉
        0.01 mg/mL 的溶液。（4）α-葡萄糖苷酶溶液：取一定量α-                 工艺，以水提液浓缩体积、醇沉浓度为考察因素，以 LP
        葡萄糖苷酶，用 PBS 制成浓度为 0.04 U/mL 的溶液。（5）                提取率为评价指标，对LP醇沉工艺进行优化。结果，浓
        PNPG 溶液：取一定量 PNPG，用 PBS 制成浓度为 0.5                  缩至原体积的40％、乙醇醇沉至含醇量的80％为最优醇
        mmol/L的溶液。（6）碳酸氢钠溶液：取一定量碳酸氢钠，                      沉工艺。
        用水制成pH为9.8的水溶液。                                        本研究采用 Sevage 法沉淀蛋白纯化 LP。虽然，水
        2.7.2  测定方法与结果        取“2.7.1”项下样品测定溶液、            提醇沉可以获得较多的 LP，但是纯化粗多糖的效果不
        阳性测定溶液各 40 μL 至 96 孔板中，加入 0.04 U/mL 的              佳；Sevage 法可以进一步纯化多糖，且条件比较温和，可
        α-葡萄糖苷酶溶液40 μL，混匀，于37 ℃孵育5 min；加入                  较好地避免多糖降解 。由于本法实为萃取，在操作中
                                                                              [22]
        0.5 mmol/L 的 PNPG 溶液 20 μL，混匀，于 37 ℃孵育 30          有可能会出现乳化现象，造成多糖损失、含量偏低，故后
        min；加入0.1 mol/L的碳酸氢钠溶液100 μL终止反应（此                 续还需考察蛋白的除去率等。
        时反应总体积达200 μL）。以PBS 40 μL为空白对照，以                       本研究对所得最优水提醇沉工艺进行了验证。3次
        PBS 40 μL代替α-葡萄糖苷酶溶液作为检测背景以消除                      验证试验结果显示，平均 LP 提取率为 7.83％（RSD＝
        检测误差，使用酶标仪于405 nm波长处检测各孔的光密                        2.52％ ，n＝3）；所 得 平 均 LP 含 量 为 56.02％（RSD＝
        度（OD），每个样品重复 3 次，计算抑制率和半数抑制浓                       1.81％，n＝3），表明该水提醇沉工艺稳定、可行。


        中国药房    2020年第31卷第16期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 16  ·1999 ·
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