Page 61 - 202016
P. 61

可证号：SCXK（川）2018-0015。自由饮食1周后，分别将                   色为止；水冲洗 1～3 min，置于 85％乙醇中静置 3～5
        2 只雌鼠和 1 只雄鼠放在同一笼中，雌鼠怀孕后再分笼                        min，以伊红染色3～5 min；水冲洗3～5 s，经乙醇梯度脱
        喂养。待乳鼠出生后，选择体质量为（6.42±0.57）g 的                     水、二甲苯透明后，以中性树胶封片后进行图像采集，每
        雄性未断乳大鼠48只作为实验对象。                                  张切片先于40倍下观察大体病变，再于100倍下观察具
        2 方法                                               体病变。
        2.1 分组、造模与给药                                       2.6 结肠组织中GFAP、NGF、TrkA蛋白表达检测
            将48只雄性未断乳大鼠喂养3 d后，随机分为6组，                          采用 Western blotting 法检测各组大鼠结肠组织中
        即正常对照组、模型组、匹维溴铵组（阳性对照，根据参                          GFAP、NGF、TrkA蛋白表达水平。将各组大鼠结肠组织
                  [10]
        考文献方法 设置剂量为 45 mg/kg）和大建中汤高、中、                     裂解后剪成碎片，匀浆，于4 ℃下以12 000 r/min离心10
        低剂量组（2.16、1.08、0.54 g/kg，以生药总量计，分别根据               min，取上清液；采用BCA法进行蛋白定量后，取煮沸变
        人临床用量的14、7、3.5倍剂量换算而得），每组8只。参                      性后的蛋白 50 μg，经 PAGE 分离、转膜、染色、剪膜、脱
        考并改良相关文献方法 复制 IBS 内脏痛模型大鼠：正                        色、封闭、洗膜后，将 PVDF膜放入一抗（稀释比例：GFAP
                            [11]
        常对照组母子同笼，其余组从出生第 4 天起母子分离 3                        1 ∶ 500，NGF 1 ∶ 1 000，TrkA 1 ∶ 5 000，GAPDH 1 ∶ 5 000）
        h/d（8：00—11：00），不予哺乳。第 8～21 天，用直径 1                中，摇床上轻摇，4 ℃孵育过夜；用 TBST 溶液洗膜 3 次，
        mm 的硬膜外导管插入大鼠肛门 1 cm 并注入 0.5％乙酸                    每次 5 min；将 PVDF 膜放入二抗（稀释比例：1 ∶ 5 000）
        0.2 mL进行直肠内刺激，每日1次，每隔2 d增加0.1 mL，                  中，摇床上轻摇，室温孵育2～3 h；用TBST膜3次，每次
        直至0.5 mL；正常对照组同法注入等体积生理盐水。第                        10 min。将 PVDF 膜平铺到保鲜膜上，以 ECL 试剂显色
        22～41 天，正常饲养，并于第 42 和 46 天分别腹腔注射                   后，于化学发光凝胶成像仪上成像，并使用 Image-Pro
        30 g/L的OVA 溶液（30 mg OVA 加入至10 g/L液态铝佐              Plus 6.0 图像分析软件处理，结果以目标蛋白相对表达
        剂 1 mL 中）1 mL，正常对照组注射等体积 PBS；第 47～                 量表示：目标蛋白相对表达量＝目标蛋白的积分光密度
        57 天,正常饲养。第 58 天，各组大鼠均按 0.1 mL/10 g 灌              值（IOD）/内参GAPDH的IOD。
        胃相应药物（溶剂均为水），正常对照组和模型组大鼠灌                          2.7  统计学方法
        胃等体积水，每日1次，连续14 d。                                     采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。数据以
        2.2  一般情况                                          x±s表示，多组间比较采用One-way ANOVA检验，两两
            观察各组大鼠造模、给药期间的一般情况，包括毛                         比较采用LSD检验（方差齐）或Tamhane’s T2检验（方差
        色、行动等。                                             不齐）。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        2.3  腹壁撤退反射（AWR）评估                                 3 结果
                        [12]
            按照文献方法 操作，末次给药后禁食不禁水12 h，                      3.1  大鼠一般情况
        腹腔注射戊巴比妥钠（0.4％，10 mL/kg）进行麻醉，将刺                        实验期间，正常对照组大鼠进食正常，毛发光泽，行
        激球囊导管插入大鼠肛门内1 cm处，并固定露出肛门外                         动灵活。模型组大鼠毛发失去光泽，行动迟缓且好扎
        的部分以防止滑脱，导管另一端连接血压计。待大鼠清                           堆，同时出现收腹、舔舐腹部等现象。大建中汤中、高剂
        醒 30 min 后分别给予 20、40、60、80 mmHg（1 mmHg＝            量组和匹维溴铵组大鼠给药14 d后，进食和毛发逐渐恢
        0.133 kPa）压力，观察结直肠扩张所产生的反应，并参照                     复正常，舔舐腹部现象消失；大建中汤低剂量组大鼠给
        Al-Chaer 标准进行评分，每次扩张时间为 20 s，重复 6                  药14 d后较模型组有改善，但没有中、高剂量组明显。
        次，每次间隔 4 min，取平均值，评分标准：大鼠情绪稳                       3.2  AWR评分变化
        定，计 0 分；偶有扭动头部，计 1 分；腹背部肌肉轻微收                          与正常对照组比较，模型组和大建中汤低剂量组大
        缩，计2分；腹背肌肉收缩的基础上出现腹部抬离地面，                          鼠在 20、40、60 mmHg 压力下的 AWR 评分均显著增加
        计3分；腹部高离地面致使腹部呈弓状，计4分 。                            （P＜0.05 或 P＜0.01）。与模型组比较，大建中汤中、高
                                               [13]
        2.4 样品采集                                           剂量组和匹维溴铵组大鼠在 20、40 mmHg 压力下的
            AWR 评估完成后，腹腔注射戊巴比妥钠（0.4％，10                    AWR评分以及大建中汤高剂量组和匹维溴铵组大鼠在
        mL/kg）进行麻醉，切开大鼠腹腔，在距离其肛门7 cm处                      60 mmHg 压力下的 AWR 评分均显著降低（P＜0.05 或
        取结肠3 cm，分为3段，于－80 ℃保存。                             P＜0.01）；同时，在40 mmHg压力下，大建中汤高剂量组
        2.5 结肠病理学观察                                        大鼠 AWR 评分显著低于匹维溴铵组（P＜0.05）。各组
            取各组大鼠结肠组织，固定，脱水，包埋，切片脱蜡                        大鼠不同压力下的AWR评分见表 1。
        至水，苏木精染色 10～20 min；水冲洗 1～3 min，用盐酸                 3.3 结肠病理学变化
        乙醇混合液（30％盐酸 1 mL+75％乙醇 99 mL）分化 5～                     正常对照组大鼠结肠上皮组织完整，黏膜连续，淋
        10 s；水冲洗1～3 min，置于50 ℃水中返蓝，直到出现蓝                   巴细胞散在，无水肿和溃疡，未见明显病理改变。模型


        中国药房    2020年第31卷第16期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 16  ·1975 ·
   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65   66