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羊抗兔单克隆自噬抗体检测试剂盒（包含多种自噬相关                            液，再用PBS 1 mL重悬细胞，以1 000 r/min离心5 min；
        蛋白的一抗及二抗）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔                            吸弃上清，加入无水乙醇固定过夜；次日加入PI染料，在
        免疫球蛋白G二抗、内参GAPDH（美国CST公司，批号：                        室温下避光染色30 min，并于2 h内采用流式细胞仪测定
        4445T、7074P2、2118S）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝                  细胞周期并计算各时相的细胞百分比。试验重复3次。
        胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒（北京索莱宝科技有限                        2.4 PPP对PC3细胞凋亡的影响考察
        公司，批号：26616）；BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo                        采用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测。取对
        Fisher Scientific 公司，批号：23227）；其余试剂均为分析             数生长期 PC3 细胞，按“2.3”项下方法消化、接种、分组、
        纯或实验室常用规格，水为超纯水。                                    给药并培养48 h后再消化、离心。收集细胞，加入Bind-
        1.3 细胞                                              ing Buffer 100 μL、Annexin V-FITC 试剂 5 μL 和 PI 试剂
            人前列腺癌 PC3 细胞株由上海赛百慷生物技术股                        10 μL，混匀，在室温下避光静置 15 min；再加入 Binding
        份有限公司提供（液氮中保存）。                                     Buffer 400 μL，用 200 目筛网滤过。采用流式细胞仪检
        2 方法                                                测细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率：细胞凋亡率（％）＝
        2.1 细胞培养和溶液配制                                       细胞凋亡数/细胞总数×100％。试验重复3次。
            取 LC3 细胞进行复苏，加入完全培养基（即含有                        2.5 PPP 对 PC3 细胞凋亡和自噬相关蛋白表达的影响
        10％FBS+1％青-链霉素双抗的 RPMI 1640 培养基），混                  考察
        匀后接种于培养瓶中，在 37 ℃、5％CO2培养箱中培养                            采用 Western blotting 法对凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2
        （以下培养条件相同），6 h后观察细胞铺板状态，次日换                         和自噬相关蛋白 LC3、Beclin-1、p62、Atg-12、Atg-16的表
        液。取处于对数生长期的细胞用于后续试验。                                达水平进行检测。取对数生长期PC3细胞，按照“2.3”项
            取 PPP 粉末，加水制成质量浓度为 800 μg/mL 的                  下方法消化、接种、分组、给药并培养 48 h 后再消化、离
        PPP母液；临用时，取该母液用完全培养基稀释，制成相                          心。收集细胞，加入RIPA裂解液100 μL+苯甲基磺酰氟
        应质量浓度的PPP药液（现用现配），用于后续试验。                          （PMSF）1 μL的混合液进行裂解后，吹打细胞，在冰上放
        2.2  PPP对PC3细胞增殖活性的影响考察                             置 2～3 h 后，以 12 000 r/min离心 15 min。取上清液，采
            采用 CCK-8 法对细胞增殖活性进行检测。取对数                       用 BCA 法测定蛋白浓度后，煮沸蛋白使其变性。取变
        生长期的 PC3 细胞，计数后，用完全培养基重悬制成                          性后的蛋白适量，进行SDS-PAGE，随后转膜1.5 h，再封
        5 000 个/mL 的细胞悬液，按每孔 100 μL 接种于 96 孔板               闭 2 h，用 TBST 缓冲液洗涤之后分别加入 Bax、Bcl-2、
        中。将细胞分为对照组和不同质量浓度的PPP干预组，                           LC3、Beclin-1、p62、Atg12、Atg-16 和 GAPDH 的一抗（稀
        培养至细胞贴壁后，弃去培养液，对照组加入完全培养                            释比例均为1 ∶ 1 000），4 ℃下孵育过夜；次日以TBST缓
        基，PPP干预组加入相应质量浓度的PPP药液（PPP终质                        冲液洗涤后，加入相应二抗（稀释比例为1∶1 000），37 ℃
                                                    [12]
        量浓度分别为 25、50、100、150、200、250、300 μg/mL ）。           下避光孵育 2 h，然后加入 ECL 超灵敏发光液曝光。采
        每组设置 6 个复孔进行重复试验。各组细胞分别培养                           用凝胶制备成像系统进行检测，以Image Lab 3.0软件对
        24、48、72 h后，分别加入CCK-8检测试液10 μL，继续培                  目标条带进行分析。以 GAPDH 为内参，按目的蛋白与
        养2 h后，采用酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度                        内参蛋白的灰度值之比表示目的蛋白的表达水平。试
        （OD），OD 值越高，即表明细胞活性越高。计算 PC3 细                      验重复3次。
        胞的增殖抑制率：增殖抑制率（％）＝（对照组平均 OD                          2.6  统计学方法
        值－PPP干预组平均OD值）/对照组平均OD值×100％，                           采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。实验数
        并据此计算PPP对PC3细胞的半数抑制浓度（IC50 ）。                       据均以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜
        2.3 PPP对PC3细胞周期的影响考察                                0.05为差异有统计学意义。
            采用流式细胞术对细胞周期分布进行检测。取对                           3 结果
        数生长期 PC3 细胞，用 0.25％胰蛋白酶消化后，以完全                      3.1 PPP对PC3细胞增殖活性的影响
        培养基制成 8 000 个/mL 的细胞悬液，按每孔 2 mL 接种                      与对照组比较，随着 PPP 质量浓度的升高，细胞的
        于6孔板中。将细胞分为对照组和PPP低、中、高质量浓                          增殖抑制率也逐渐升高；当以 200 μg/mL 及以上的 PPP
        度组，培养至细胞贴壁后，弃去培养液，对照组加入完全                           培养48 h时，细胞增殖抑制率不再明显升高；当以150～
        培养基，药物组加入低、中、高质量浓度的 PPP 药液（质                        300 μg/mL 的 PPP 分别培养 24 h 及以 50～300 μg/mL 的
        量浓度参考“2.2”项下 IC50 值结果的 0.5、1.0、2.0 倍设               PPP分别培养48、72 h时，细胞增殖抑制率均显著低于对
        置），继续培养 48 h。培养完毕后，弃去培养液，用 PBS                      照组（P＜0.05 或 P＜0.01），且 PPP 作用 48、72 h 时的细
        洗2～3次，每次3 mL；以0.25％胰蛋白酶消化细胞后，加                      胞增殖抑制率较为接近。因此，后续试验选择48 h为培
        入完全培养基3 mL，以1 000 r/min离心5 min；吸弃上清                 养时间。此外，根据SPSS 21.0软件计算出PPP对PC3细


        ·1980 ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 16                                 中国药房    2020年第31卷第16期
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