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2.5 L-SHK联合DDP对HeLa/DDP细胞周期分布的影 x±s 表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两
响考察 两比较用 LSD-t 检验。以 P＜0.05 表示差异有统计学
采用流式细胞术检测。取“2.2”项下对数生长期的 意义。
HeLa/DDP 细胞适量，以 5 000 个/孔接种于 24 孔培养板 3 结果
中，培养 24 h 后，将细胞分为空白对照组、DDP 组以及 3.1 HeLa/DDP耐药细胞的耐药指数
DDP+低、中、高剂量L-SHK组。空白对照组加入完全培 DDP 对 HeLa/DDP 细胞的 IC50 值为（35.82±0.34）
养基 1 mL，各给药组加入含相应药物的完全培养基 1 mg/L，显著高于其对 HeLa 细胞的（3.04±0.43）mg/L
mL（DDP 最终质量浓度均为 2 mg/L，低、中、高剂量 （P＜0.05）；HeLa/DDP 细胞的耐药指数为 11.8，为中度
L-SHK的最终浓度分别为0.3、0.6、1.2 μmol/L），每组设3 耐药。
个复孔。培养48 h后，收集细胞，用4 ℃的PBS清洗2次
3.2 L-SHK对HeLa/DDP细胞的抑制及耐药逆转作用
后，置于 4 ℃的 70％乙醇中固定过夜；以 1 000 r/min 离
3.2.1 L-SHK 对 HeLa/DDP 细胞的抑制作用 L-SHK
心5 min，弃去上清液，用预冷的PBS清洗2次，弃去上清 作用后 HeLa/DDP 细胞的抑制率见图 1。由图 1 可见，
液；每管加入PI试剂500 μL，同时加入RNA酶A使其最
L-SHK 对 HeLa/DDP 细胞的抑制率有随剂量增加而逐
终质量浓度达100 μg/mL，于4 ℃染色15 min后，使用流
渐升高的趋势，其 IC50为 3.92 μmol/L。结合上述结果并
式细胞仪测定各细胞周期的分布比例。
[15]
参考本课题组前期试验结果 ，发现当 L-SHK 为 0.3、
2.6 L-SHK 联合 DDP 对 HeLa/DDP 细胞凋亡的影响
0.6、1.2 μmol/L 时，其对 HeLa/DDP 细胞的抑制作用较
考察
小，故以这3个浓度分别作为后续试验的低、中、高剂量。
采用流式细胞术检测。取“2.2”项下对数生长期的
100
HeLa/DDP 细胞适量，以 5 000 个/孔接种于 12 孔培养板 90
80
中，培养 24 h 后，按“2.5”项下方法分组、给药，每组设 3 70
％ 60
个复孔。培养 48 h 后，用不含 EDTA 的胰酶消化，以 抑制率， 50
1 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，以PBS洗涤2次， 40
30
收集细胞。每组细胞分别加入Annexin Ⅴ-FITC结合液 20
10
195 μL，轻轻重悬；再于暗室内加入 Annexin Ⅴ-FITC 染 0 0 5 10 15 20
L-SHK剂量，μmol/L
色液 5 μL，轻轻混匀；最后加入 PI 试剂 5 μL，混匀，于室
图1 L-SHK作用后HeLa/DDP细胞的抑制率
温避光孵育 10 min 后，使用流式细胞仪检测其早期、晚
Fig 1 Inhibitory rate of L-SHK to HeLa/DDP cells
期凋亡率及总凋亡率。
2.7 L-SHK联合DDP对HeLa/DDP细胞凋亡相关蛋白 3.2.2 L-SHK 对 HeLa/DDP 细胞的耐药逆转作用 L-
表达的影响考察 SHK 作用后 HeLa/DDP 细胞的 IC50 和逆转指数见表 1。
采用 Western blotting 法检测。取“2.2”项下对数生 由表1可见，与DDP组比较，DDP+低、中、高剂量L-SHK
长期的 HeLa/DDP 细胞适量，以 5 000 个/孔接种于 12 孔 组的IC50值均显著降低，且DDP+中、高剂量L-SHK组显
培养板中，培养24 h后，按“2.5”项下方法分组、给药，每 著低于 DDP+低剂量 L-SHK 组，DDP+高剂量 L-SHK 组
组设3个复孔。培养48 h后，加入RIPA细胞裂解液100 显著低于DDP+中剂量L-SHK组（P＜0.05），呈剂量依赖
μL，充分混匀，冰浴 30 min，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离 性；DDP+低、中、高剂量 L-SHK 组的逆转倍数分别为
心20 min，收集上清液，以DC法测定蛋白含量。蛋白经 1.38、2.80、6.71。
上样缓冲液稀释后，于100 ℃下变性5 min。取变性后的 表1 L-SHK作用后HeLa/DDP细胞的IC50和逆转指数
蛋白样品适量，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电 （x±±s，n＝3）
泳（电压：80～180 V）；电泳后，于 80 V 下转移至聚偏二 Tab 1 IC50 and reversal index of L-SHK to HeLa/DDP
氟乙烯（PVDF）膜上；以5％脱脂奶粉封闭1 h后，分别加
cells（x±±s，n＝3）
入相应一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用三
组别 IC50，mg/L 逆转倍数
羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TBST）溶液清洗5 min×3次，加 DDP组 35.82±0.84
入相应二抗（稀释度为1 ∶ 5 000），室温孵育1 h；用TBST DDP+低剂量L-SHK组 25.88±0.51 ＊ 1.38
DDP+中剂量L-SHK组 12.79±0.48 ＊# 2.80
溶液清洗5 min×3次，以ECL发光液显色处理后，置于凝
DDP+高剂量L-SHK组 5.34±0.26 ＊#Δ 6.71
胶成像仪上成像并采用Image J v1.7.0软件分析，以相应
＊
#
注：与 DDP 组， P＜0.05；与 DDP+低剂量 L-SHK 组比较，P＜
蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示该蛋白的表达量。
0.05；与DDP+中剂量L-SHK组比较，P＜0.05
Δ
2.8 统计学方法 Note：vs. DDP group，P＜0.05；vs. DDP+low-dose L-SHK group，
＊
采用SPSS 15.0软件对数据进行统计分析。数据以 # P＜0.05；vs. DDP+medium-dose L-SHK group，P＜0.05
Δ
·1870 · China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15 中国药房 2020年第31卷第15期