Page 83 - 202015
P. 83

in Ⅴ-FITC/PI）凋亡检测试剂盒、RNA 酶 A（北京索莱宝                 HeLa和HeLa/DDP细胞适量，以5 000个/孔接种至96孔
        科技有限公司，批号分别为 C0080、R10030）；CCK-8 检                 培养板中，培养24 h后，将细胞随机分为对照组（即DDP
        测试剂（日本 Dojindo 公司，批号：KN709）；RIPA 细胞裂               组）和不同剂量药物组。对照组加入完全培养基 100
        解 液（美 国 Sigma 公 司 ，批 号 ：C0157）；兔 抗 人 Bax、          μL，各药物组加入含DDP的完全培养基100 μL（DDP的
        Bcl-2、剪切型胱天蛋白酶 3（Cleaved caspase-3）、β-肌动           最终质量浓度分别为 0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32
        蛋白（β-actin）抗体（美国 ImmunoWay Biotechnology 公         mg/L，剂量设置参考前期预试验所得 DDP 对非耐药细
        司，批号分别为 YM2631、YT0278、YC0002、YM2018）；              胞的作用浓度 ），每组设 3 个复孔。培养 48 h 后，弃去
                                                                        [9]
        蛋白上样缓冲液、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫                           培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL；培养2.5 h后，使用
        球蛋白 G 抗体（碧云天生物技术研究所，批号：P0013、                      酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，在
        A0217）；DC 蛋白定量试剂盒（美国 Bio-Rad 公司，批号                 计算抑制率、半数抑制浓度（IC50 ）的基础上，计算 HeLa/
        1702409）；Western blotting 试验显影液、定影液（天津开            DDP 细胞的耐药指数。抑制率＝（1－试验组细胞 OD
        发区宏丰科工贸有限公司）；ECl 发光液由本实验室自                         值/对照组细胞 OD 值）×100％；耐药指数＝药物对耐药
        制；二甲基亚砜（DMSO）等试剂均为分析纯，水为超                          细胞的 IC50/药物对敏感细胞的 IC50 （当耐药指数＜5 时，
        纯水。                                                为低度耐药；当耐药指数为 5～15 时，为中度耐药；当耐
        1.3 细胞                                             药指数＞15 时，为高度耐药 ）。上述试验重复 3 次（下
                                                                                   [16]
            人宫颈癌HeLa细胞系由天津市肿瘤医院公共实验                        同）。
        室提供。                                               2.4 L-SHK对 HeLa/DDP的增殖抑制作用及耐药逆转
        2 方法                                               作用考察
        2.1  溶液的配制                                         2.4.1 L-SHK 对 HeLa/DDP 的 增 殖 抑 制 作 用        采 用
            称取 L-SHK 对照品 10 mg，溶于 DMSO 1 mL 中，制            CCK-8 法检测。取“2.2”项下对数生长期的 HeLa/DDP
        成浓度为34.7 μmol/L的L-SHK贮备液，置于4 ℃冰箱中                  细胞适量，以 5 000 个/孔接种至 96 孔培养板中，培养 24
        保存；以DDP注射液作为DDP贮备液（5 g/L），于4 ℃冰                    h后，将细胞随机分为对照组（即DDP组）和不同剂量药
        箱中冷藏保存。                                            物组。对照组加入含 DDP 的完全培养基 100 μL（DDP
        2.2  HeLa细胞及HeLa/DDP细胞的培养                          的最终质量浓度为2 mg/L，剂量设置参考该药表观分布
        2.2.1 HeLa细胞     取出冻存的HeLa细胞，在37 ℃水浴               容积及“2.3”项下试验结果，下同），各药物组加入同时含
        中迅速融化，以1 000 r/min离心5 min，沉淀加入含10％                 L-SHK 和 DDP 的完全培养基 100 μL（DDP 最终质量浓
        胎牛血清的 RPMI 1640 培养液（以下简称“完全培养                      度均为 2 mg/L，L-SHK 的最终浓度分别为 0.125、0.25、
        基”）1 mL，吹打均匀后接种至培养皿中，于 37 ℃、5％                     0.5、1、2、4、8、16 μmol/L；剂量设置参考前期预试验所得
        CO2及饱和湿度条件下培养（培养条件下同）。观察细胞                         L-SHK 对非耐药细胞的作用浓度 ），每组设 3 个复孔。
                                                                                         [9]
        形态及数量，待细胞长满培养皿的 80％时传代 1 次，具                       培养 48 h 后，弃去培养基，每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL；
        体操作如下：吸弃培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH                         培养 2.5 h 后，使用酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔的
        7.5）清洗 1～2 次，加入含 EDTA 的 0.25％胰酶、PBS 各 1            OD值，按“2.3”项下方法计算抑制率。
        mL，消化 2～3 min，加入不含血清的 RPMI 1640 培养液                2.4.2 L-SHK 对 HeLa/DDP 的 耐 药 逆 转 作 用        采 用
        终止消化，吹打制成细胞悬液，再按细胞悬液与培养液                           CCK-8 法测定。取“2.2”项下对数生长期的 HeLa/DDP
        体积比1∶3进行传代，培养，即得HeLa细胞。                            细胞适量，以 5 000 个/孔接种至 96 孔培养板中，培养 24
        2.2.2 HeLa/DDP 细胞     取出冻存的 HeLa 细胞按照              h后，将细胞随机分为对照组（即DDP组）和不同剂量药
       “2.2.1”项下方法复苏后，加入完全培养基1 mL，培养，待                     物组。对照组加入含 DDP 的完全培养基 100 μL（DDP
        细胞长满培养皿的80％后按“2.2.1”项下方法传代，待传                      的最终质量浓度为 2 mg/L），各药物组分别加入同时含
        代细胞长至对数生长期时，将培养基更换为含DDP 100                        DDP 和 L-SHK 的完全培养基 100 μL（DDP 的最终质量
        μg/L 的 RPMI 1640 培养液，继续培养 48 h 后，弃去原培              浓度均为2 mg/L，低、中、高剂量L-SHK的最终浓度分别
        养液，更换为完全培养基继续培养。待细胞长满培养皿                           为0.3、0.6、1.2 μmol/L；剂量设置参考“2.4.1”项下结果及
                                                                        [15]
        的80％后同法传代，待传代细胞长至对数生长期时加入                          前期试验结果 ，下同），每组设3个复孔。培养48 h后，
        DDP（质量浓度为前次培养的2倍），反复换药培养，直至                        弃去培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL；培养2.5 h后，
        DDP质量浓度达100 mg/L（根据前期预试验结果确定），                     使用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的OD值，按“2.3”
        即得HeLa/DDP细胞。                                      项下方法计算抑制率和 IC50，并计算逆转倍数。逆转倍
        2.3  HeLa/DDP细胞耐药指数的检测                             数＝使用逆转剂前药物对细胞的 IC50/使用逆转剂后药
            采用 CCK-8 法检测。取“2.2”项下对数生长期的                    物对细胞的IC50。


        中国药房    2020年第31卷第15期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15  ·1869  ·
   78   79   80   81   82   83   84   85   86   87   88