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算细胞迁移率[细胞迁移率＝（细胞迁移前的划痕距 发光图像分析系统分析蛋白的相对灰度值来表示目的
离－细胞迁移后的划痕距离）/细胞迁移前的划痕距离× 蛋白的相对表达水平。
100％]。 2.6 分子对接试验
2.4 柠檬酚对细胞骨架相关蛋白 mRNA 表达水平的 从 PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）下载 F-actin、
影响 β-tubulin、Ezrin 的蛋白结构，其 PDB ID 分别为 2ZWH、
采用 RT-PCR 法检测 HepG2 细胞骨架相关蛋白的 4U3J、4RM8，采用分子对接软件 Schrodinger 2015 中的
mRNA表达水平。取对数生长期的HepG2细胞，按1×10 6 Schrodinger Maestro模块中的Prep Wiz功能对蛋白结构
个/孔接种于 6 孔板中，分为阴性对照组和柠檬酚低、高 进行预处理：加氢、去除水分子、补残基，使用 OPLS3 力
浓度组（终浓度为 50、100 μmol/L），每组设置 2 个复孔。 场对各蛋白进行限制能量优化，使重原子的坐标均方根
[8]
将细胞培养至细胞融合率达 80％后，弃上清液，柠檬酚 偏差收敛于0.3 Å 。使用Grid Generation模块定义格点
低、高浓度组加入相应浓度的含药培养基，阴性对照组 文件，以晶体结构的原有配体所在位点为中心，根据不
加入等体积培养基。将细胞置于细胞培养箱中培养 24 同受体定义活性口袋的位置。将“sdf ”格式的柠檬酚结
h 后，收集细胞，并提取总 RNA。按逆转录试剂盒说明 构文件导入 Canvas 2.4 模块，导出生成格式为“mae”的
书操作，先将 RNA 逆转录为 cDNA，再按荧光定量 PCR 文件，再将其导入 Maestro 10.2 模块，选择 ligpre 模块自
试剂盒说明书操作进行 PCR 扩增。扩增程序：95 ℃预 动生成柠檬酚 3D 结构。将蛋白受体与柠檬酚 3D 结构
变性 2 min；95 ℃变性 5 s，60 ℃退火 30 s，60 ℃延伸 30 在One-Step Glide Docking模块中进行对接，并选择对接
s，40个循环。采用荧光分析软件对产物进行分析，并以 模式为SP，生成2D平面图。
GAPDH 为内参，采用 2 －ΔΔCt 法计算 F-actin、β-tubulin、Ez- 2.7 统计学方法
rin mRNA的相对表达水平。引物信息见表1。 采用SPSS 22.0进行数据分析。计量资料以x±s表
表1 引物信息 示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差
Tab 1 Primer information 异有统计学意义。
3 结果
基因名称 引物序列（5′→3′） 产物长度，bp
GAPDH 上游：AATCAAGTGGGGCGATGCTG 86 3.1 柠檬酚对HepG2细胞增殖的影响结果
下游：GCAAATGAGCCCCAGCCTTC 86 与阴性对照组比较，柠檬酚不同浓度组HepG2细胞
F-actin 上游：GAGGAAGACAGCACCGTACC 141
下游：ATGGGGTCATCCTTTCGCAG 141 培养24 h后，其细胞增殖抑制率均显著增加（P＜0.05或
β-tubulin 上游：AAATCGGCGCCAAGTTCTGG 147 P＜0.01）；且随柠檬酚浓度的增加，其增殖抑制作用越
下游：ACCGGACGCCTCATTGTAGT 147
Ezrin 上游：CGGCTGATCCCTCAAAGAGTG 102 强。柠檬酚对HepG2细胞的IC50为77.59 μmol/L。柠檬
下游：TTTGAGCATCCCACGGTGTT 102 酚对HepG2细胞增殖的影响见表2。
2.5 柠檬酚对细胞骨架相关蛋白表达水平的影响 表2 柠檬酚对HepG2细胞增殖的影响（x±±s，n＝6）
采用 Western blotting 法检测 HepG2 细胞骨架相关 Tab 2 Effects of citrusinol on the proliferation of
蛋白的表达水平。取对数生长期的 HepG2 细胞，以 2× HepG2 cells（x±±s，n＝6）
10 个/孔接种于6孔板中，分为阴性对照组和柠檬酚低、 组别 OD值 细胞增殖抑制率，％
6
阴性对照组 0.989±0.047 0
高浓度组（终浓度为50、100 μmol/L），每组2个复孔。将
柠檬酚12.5 μmol/L组 0.824±0.054 16.68±5.46 ＊
细胞培养至细胞融合率达80％后，弃上清液，柠檬酚低、 柠檬酚25 μmol/L组 0.619±0.034 37.41±3.43 ＊＊
高浓度组加入相应浓度的含药培养基，阴性对照组加入 柠檬酚50 μmol/L组 0.557±0.044 43.68±4.45 ＊＊
柠檬酚100 μmol/L组 0.252±0.050 74.52±6.95 ＊＊
等体积培养基。将细胞置于细胞培养箱中培养24 h后，
柠檬酚200 μmol/L组 0.138±0.018 86.05±8.42 ＊＊
收集细胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），提取总 注：与阴性对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
蛋白；以 BCA 法检测蛋白浓度后，进行蛋白变性处理。 Note：vs. negative control group，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
取变性后蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳 3.2 柠檬酚对HepG2细胞迁移能力的影响
（SDS-PAGE），再转移至PVDF膜上，室温封闭1 h后，以 与阴性对照组[细胞迁移率为（92.35±5.36）％]比
TBST 缓冲液清洗 5 min×3 次；分别加入β-actin、F-actin、 较，柠檬酚低、高浓度组细胞迁移率显著降低（P＜
β-tubulin、Ezrin 抗体（稀释比例均为 1 ∶ 1 000），4 ℃下孵 0.01），细胞迁移率分别为（62.48±2.27）％、（48.63±
育过夜；以 TBST 缓冲液清洗 5 min×3 次，再加入二抗 3.25）％，表明柠檬酚能显著抑制 HepG2 细胞的迁移能
（稀释比例为1 ∶ 5 000），室温孵育1 h；以TBST缓冲液清 力。各组细胞划痕试验显微图见图 2，细胞迁移率的测
洗 5 min×3 次，加入显色液，以β-actin 为内参，采用化学 定结果见图3。

中国药房 2020年第31卷第15期 China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15 ·1851 ·