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抗肿瘤活性，如桑辛素（Morusin）对人非小细胞肺癌                         1967534）；CCK-8 试 剂 盒（日 本 Dojindo 公 司 ，批 号 ：
        A549细胞和人乳腺癌MCF7、MDA-MB-231细胞均具有                     CK04）；兔抗Ezrin、F-actin、β-tubulin、β-actin单克隆抗体
                         [3]
        强烈的抗肿瘤活性 。由此推测，柠檬酚也可能具有潜                           （北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG12013984、
        在的抗肿瘤活性。                                            AH11168240、AG07178634、AG0719703）；反转录试剂
                                                            盒[纽英伦（北京）生物技术公司，批号：M0303S]；荧光定
                                                            量 PCR 试剂盒（美国 Thermo Fisher Scientific 公司，批
                                                            号：26616）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公
                                                            司，批号：P0013B）；BCA 蛋白定量试剂盒（杭州联科生
                                                            物技术股份有限公司，批号：R7204）；辣根过氧化物酶标
                                                            记山羊抗兔免疫球蛋白 G 二抗（北京博奥森生物技术
                     图1 柠檬酚的化学结构式
                                                            有 限公司，批号：bs-40296G）；3-磷酸甘油醛脱氢酶
           Fig 1 Chemical structural formula of citrusinol
                                                           （GAPDH，南京捷尼斯生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲
            本课题组前期研究发现，柠檬酚可以通过破坏人肝
                                                            液（PBS，pH 为 7.2～7.4）、青霉素、链霉素均购自美国
        癌HepG2细胞聚合纤维状肌动蛋白（F-actin）骨架，阻止
                                                            Hyclone公司；无水乙醇、异丙酮、氯仿等均为分析纯；其
        纺锤体形成，从而抑制人肝癌 HepG2 细胞的增殖 。相
                                                   [4]
                                                            他试剂为实验室常用试剂，水为超纯水。
        关研究发现，F-actin骨架的重组是细胞黏附能力和细胞                        1.3 细胞
        形态改变得以实现的关键，当药物干预后可引起细胞骨
                                                                人肝癌细胞HepG2购自美国ATCC细胞库。
        架蛋白解聚，从而导致凋亡的发生               [5-6] 。Rao J等 的研究     2 方法
                                                 [7]
        表明，细胞骨架聚合/解聚状态的改变，对恶性肿瘤细胞
                                                            2.1  细胞培养
        的形态和表型有非常重要的调节作用，故推测干预细胞
                                                                取 HepG2 细胞，置于含 10％胎牛血清的 DMEM 培
        骨架重组可作为抗癌药物的作用靶点。基于此，笔者在
                                                            养基（以下简称“培养基”）中，于37 ℃、5％CO2条件下培
        前期研究的基础上，采用CCK-8法检测柠檬酚对HepG2
                                                            养（以下培养条件相同）。
        细胞增殖的影响，采用划痕试验检测柠檬酚对HepG2细
                                                            2.2  细胞增殖试验
        胞迁移的影响，采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）                            采用 CCK-8 法进行细胞增殖检测。将对数生长期
        和 Western blotting 法检测 HepG2 细胞中 F-actin、β-微管       的HepG2细胞接种至96孔培养板中，每孔约1×10 个细
                                                                                                       4
        蛋白（β-tubulin）、埃兹蛋白（Ezrin）的mRNA及其蛋白表                 胞，于细胞培养箱中培养24 h后，弃上清液，然后将细胞
        达水平，然后采用分子对接方法考察柠檬酚与上述3种                            分为阴性对照组和柠檬酚不同浓度组（终浓度为 12.5、
        蛋白的相互作用方式，以期为抗肿瘤活性分子的筛选及                            25、50、100、200 μmol/L），每组设置6个复孔。柠檬酚不
        相关新药开发提供参考。                                         同浓度组加入相应浓度的含药培养基，阴性对照组加入
        1 材料                                                等体积培养基。将细胞继续培养24 h后，每孔加入CCK-
        1.1  仪器                                             8工作液100 μL，置于细胞培养箱中培养1 h后，采用酶标
            BJ-J1606型细胞培养箱（上海博迅医疗生物仪器股                      仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度（A），并计算细胞
        份有限公司）；CKX53型倒置相差显微镜（日本Olympus                      增殖抑制率[细胞增殖抑制率＝（A 阴性对照组－A 柠檬酚不同浓度组 ）/
        公司）；ATY224 型电子天平（日本 Shimadzu 公司）；                   A 阴性对照组×100％]，再通过SPSS 20.0软件计算柠檬酚的半
        Z-11D 型 超 声 波 细 胞 破 碎 仪（日 本 Toshiba 公 司）；           数抑制浓度（IC50 ）。
        H1850R 型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪天平仪器设                         2.3 细胞划痕试验
        备有限公司）；Multiskan Fc 型酶标仪、ST70-2 型微孔板                    将对数生长期的 HepG2 细胞，接种于 6 孔板中，每
        恒温振荡器、7500 型荧光定量 PCR 仪（美国 Thermo                    孔约 1×10 个细胞。将细胞培养至融合率达 95％后，分
                                                                     6
        Fisher Scientific 公司）；Tanon 5500 Multi 型全自动化学       为阴性对照组和柠檬酚低、高浓度组（终浓度为 50、100
        发光/荧光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；                            μmol/L），每组设置 2 个复孔。用无菌处理后的 1 mL 枪
        1645050型基础电泳仪（美国Bio-Rad公司）。                         头尖端垂直在细胞表面划出一条直线，再用 PBS 冲洗，
        1.2 药品与试剂                                           除去漂浮的细胞，加入新鲜培养基，于显微镜下拍照，记
            柠檬酚（本实验室自制，纯度：≥98％）；高糖DMEM                      录划痕位置。将各孔的上清液吸除后，柠檬酚低、高浓
        培养基（美国 Hyclone 公司，批号：AD12854263）；胎牛                 度组加入相应浓度的含药培养基，阴性对照组加入等体
        血 清（杭 州 四 季 青 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ，批 号 ：            积培养基。将细胞置于细胞培养箱中培养24 h后，置于
        18090505）；0.25％ 胰 酶（美 国 Gibco 公 司 ，批 号 ：            显微镜下拍照，利用 Image J 2.1.4.7软件分析图片，并计


        ·1850  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15                                中国药房    2020年第31卷第15期
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