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group and berberine high-dose group were increased significantly，while the protein expression of CD206 in berberine high-dose
        group was significantly higher than atorvastatin calcium group （P＜0.05）. CONCLUSIONS：Different doses of berberine can
        intervene in mice macrophage polarization to different extents，the mechanism of which may be associated with the regulation of
        TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway.
        KEYWORDS    Berberine；Mice macrophage；RAW264.7 cell；Polarization；TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway


            动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是一种慢性炎               晶欣生物科技有限公司；阿托伐他汀钙片（阳性对照，辉
                [1]
        症性疾病 。有研究指出，AS斑块中存在大量的免疫细                          瑞制药有限公司，批号：6958703500744，规格：20 mg/片）；
                                 [2]
        胞如巨噬细胞、树突状细胞等 。其中，巨噬细胞作为斑                          二甲基亚砜（DMSO）、脂多糖（LPS）（美国 Sigma 公司，
        块组织中炎症因子的主要来源和先天性免疫应答中的                            批号分别为D4540、L2880）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白
                                                     [3]
        主要免疫细胞，在 AS 的进展过程中发挥了关键作用 。                        细胞介素6（IL-6）、NF-κB酶联免疫吸附测定（ELISA）检
        巨噬细胞是一种多相细胞，可在不同因子的诱导下极                            测试剂盒（广州英韦创津生物科技有限公司，批号分别
        化，即被不同细胞因子激活后活化为M1型或M2型巨噬                          为 SDFGT1589、SDFGT1573、SDFGT15812）；cDNA 合
        细胞，其中M1型巨噬细胞分泌的细胞因子具有促AS的                          成试剂盒（美国 Thermo Fisher Scientific 公司，批号：
                                                  [4]
        作用，M2 型巨噬细胞则可增加 AS 斑块的稳定性 。因                       00351597）；兔抗小鼠TLR4、MyD88、诱导型一氧化氮合
        此有学者指出，调节巨噬细胞的极化可能成为抗 AS 作                         酶（iNOS）、CD206、甘油醛-3-硫酸脱氢酶（GAPDH）抗体
                      [3]
        用研究的新靶点 。核因子κB（NF-κB）是一种重要的转                       （内参）（武汉博士德生物工程有限公司，批号分别为
        录因子，可参与调控多种与炎症反应相关的细胞因子、                           BSD-GS77908、BSD-GS23903、BSD-GS67905、BSD-
        黏附分子的表达，其激活与巨噬细胞极化密切相关                      [5-6] 。  GS44907、BSD- GS76901）；辣根过氧化物酶标记的山羊
        脂多糖（LPS）是引起炎症性疾病的主要原因之一 。有                         抗小鼠免疫球蛋白 G（IgG）二抗（武汉华美生物工程有
                                                  [7]
        研究证实，LPS可通过识别并结合Toll样受体4（TLR4），                    限公司，批号：CSB-PA644737）；其余试剂均为分析纯，
        经TLR4/髓样分化因子88（MyD88）途径激活NF-κB              [8-9] 。  水为蒸馏水。
            黄连素作为中药黄连的主要有效成分之一，已有研                         1.3  细胞
        究证实其可通过抗炎作用抑制AS斑块的形成                   [10-11] ，但具     小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株由中国科学院上海
        体机制尚未完全阐明。本研究基于TLR4/MyD88/NF-κB                    生科院细胞资源中心提供。
        信号通路，初步探讨了黄连素对小鼠 RAW264.7 巨噬细                      2 方法
        胞极化的干预作用，以期为临床防治 AS 提供新的靶点                         2.1  细胞培养
        和思路。                                                   将 RAW264.7 细 胞 接 种 于 含 10％ 胎 牛 血 清 的
        1 材料                                               DMEM 高糖培养基中，于 37 ℃、5％CO2条件下（下同）

        1.1  仪器                                            培养48 h，以1 000 r/min离心5 min；弃去上清液，沉淀加
            HEPA Class100 型 CO2 培养箱（美国 Thermo Fisher       入 PBS 适量，再加入 RPMI 1640 培养基混匀、重悬并计
        Scientific 公司）；Rotofix 32A 型离心机（德国 Hettich 公       数，制成密度为1×10 个/mL的细胞悬液，备用。
                                                                             6
        司）；SpectraMax Plus 384型全自动酶标仪（美国Molecu-            2.2  分组、造模与给药
        lar Devices公司）；BioDoc-IT型凝胶成像系统（美国UVP                  取“2.1”项下RAW264.7细胞悬液适量，按100 μL/孔
        公司）；UV-6100S 型紫外分光光度计（上海元析仪器有                      接种于96孔板中，并随机分为空白对照组、LPS诱导组、
                                                                                                        [12]
        限公司）；ABI 7500 型实时荧光定量聚合酶链反应                        阿托伐他汀钙组（10 μmol/L，剂量设置参考文献方法 ）
       （PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；BT25S型电子天平（德国                   和黄连素低、中、高剂量组（5、10、20 μmol/L，剂量设置参
        Sartorius公司）。                                      考本课题组前期预试验结果），每组设3个复孔。空白对
        1.2 药品与试剂                                          照组和 LPS 诱导组均不加入药物；LPS 诱导组加入 LPS
            黄连素原料药（批号：HY-N0197，纯度：98％）以及                   （终质量浓度为100 μg/L），其余各药物组经相应药物预
        胎牛血清、DMEM 高糖培养基、磷酸盐缓冲液（PBS，pH                      处理2 h后再加入等量LPS（终质量浓度为100 μg/L），培
        7.2）、RPMI 1640 培养基、蛋白裂解液（RIPA）、TRIzol 试            养24 h以复制细胞炎症模型。
        剂、实时荧光定量 PCR 试剂盒（含 SYBR 荧光染料等试                     2.3 相关指标检测
        剂）、ECL 化学发光试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰                        2.3.1  细胞培养液中TNF-α、IL-6、NF-κB的含量            采用
        胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒                     ELISA法检测。收集“2.2”项下各组细胞培养液，于4 ℃
       （ 批 号 分 别 为 ISEQ00010、ISEQ00023、ISEQ00812、          下以12 000 r/min离心10 min，收集上清液，使用全自动
        WSED00972、WSED08821、WSED56324、CSB-E08324r、         酶标仪检测其中TNF-α、IL-6、NF-κB含量。严格按照相
        CSB-E08453r、CSB-E09971r、CSB-E09576r）均购自广东          应试剂盒说明书操作。上述试验重复3次。


        中国药房    2020年第31卷第15期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 15  ·1805  ·
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