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1.3 细胞株                                            2.6 ROS含量检测
            小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海                          采用2′，7′-二氯荧光素（DCF）法检测。取对数生长
        细胞库。                                               期的RAW264.7细胞以4×10 个/mL接种于96孔板中，每
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        2 方法                                               孔100 μL。将细胞随机分为对照组（0.5％DMSO）、LPS
        2.1 GOEE的制备                                        模型组（1 μg/mL）、NAC 处理组（抗氧化剂，10 mmol/L
            取新鲜岭南山竹子果皮（80 g）切成片，用70％乙醇                     NAC+1 μg/mL LPS，NAC 剂量设置参考前期预试验结
       （0.8 L）回流提取3次，每次2.5 h。将提取液过滤并减压                     果）和GOEE处理组（50、100、150、200、300 μg/mL GOEE+
        浓缩后，冷冻干燥，即得到 GOEE 冻干品 5.26 g，得率为                   1 μg/mL LPS），每组设4个复孔。按“2.4”项下方法培养
        6.58％。                                             24 h 后，吸弃培养液，将细胞与 DCFH-DA（10 mmol/L）
        2.2 GOEE中总多酚与总黄酮的含量测定                              100 μL 孵育 30 min，采用全功能酶标仪于激发波长 488
            采用Folin-Ciocalteau法 测定GOEE中的总多酚含               nm、发射波长 525 nm 处检测 ROS 与 DCFH-DA 反应产
                                [13]
        量，以没食子酸为指标，结果以没食子酸含量表示；采用                          物（DCF）的荧光强度，并以此表示ROS的含量。严格按
                               [14]
        NaNO2-Al（NO3 ） 3-NaOH 法 测定 GOEE 中总黄酮的含             照试剂盒说明书操作，上述试验重复3次。
        量，以芦丁为指标，使用紫外-可见分光光度计在500 nm                       2.7 TNF-α、IL-6、IL-1β水平检测
        波长处检测样品含量，方法学考察内容及其结果见相关                               采用 ELISA 法检测。取对数生长期的 RAW264.7
                                                                      5
        文献  [13-14] 。每样品均重复测定3次。                           细胞以2×10 个/mL接种于6孔板中，每孔1 mL。将细胞
        2.3 细胞培养                                           随机分为对照组（0.5％DMSO）、LPS 模型组（1 μg/mL）、
            将对数生长期的细胞接种于含 10％胎牛血清、1％                       DEX处理组（0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS）和GOEE处
        青链霉素双抗的高糖DMEM培养基中，并置于5％CO2、                        理组（100、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS，GOEE
        37 ℃的培养箱中培养（培养条件下同）。                               剂量参考前文结果，下同），每组设4个复孔。按“2.4”项
        2.4  GOEE对LPS诱导RAW264.7细胞的毒性研究                     下方法培养24 h后，收集各孔细胞培养液，以1 000 r/min
            采用 MTT 法检测。取对数生长期的 RAW264.7 细                  离心5 min，取上清液，采用ELISA法以连续光谱扫描式
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        胞以 5×10 个/mL 接种于 96 孔板中，每孔 100 μL。将细               酶标仪于 450 nm 波长处检测细胞培养液中 TNF-α、
        胞随机分为对照组（0.5％DMSO）、LPS模型组（1 μg/mL，                 IL-6、IL-1β水平。严格按照试剂盒说明书操作，上述试
        剂量设置参考前期预试验结果，下同）和 GOEE 处理组                        验重复3次。
       （15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000 µg/mL GOEE+    2.8  相关蛋白表达水平检测
        1 μg/mL LPS，GOEE 以生药量计，剂量设置参考前期预                       采用 Western blotting 法检测。取对数生长期的
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        试验结果），每组设4个复孔。除对照组外，其余各组均                          RAW264.7 细胞以 4×10 个/mL 接种于 96 孔板中，每孔
        与LPS共孵育30 min后，再与药物混合培养。培养24 h                     100 μL。将细胞随机分为对照组（0.5％DMSO）、LPS模
        后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 µL，培养4 h，吸弃                 型组（1 μg/mL）、DEX 处理组（0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL
        上清液，每孔加入DMSO 150 µL，避光振摇10 min，采用                  LPS；检测 NRF2 信号通路相关蛋白 HO-1、NRF2 表达时
        连续光谱扫描式酶标仪在490 nm波长处测量各孔的吸                         不 设 该 组）和 GOEE 处 理 组（100、200、300 μ g/mL
        光度值，并计算各组细胞的存活率：细胞存活率（％）＝                          GOEE+1 μg/mL LPS），每组设4个复孔。培养1 h后，吸
        试验组吸光度值/对照组吸光度值×100％。上述试验重                         弃培养液。分别按试剂盒说明书提取细胞总蛋白（用以
        复3次。                                               检测p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、HO-1蛋白的表达）和细胞
        2.5 NO含量检测                                         核蛋白（用以检测NRF2蛋白的表达），用BCA蛋白浓度
            采用Griess法检测。取对数生长期的RAW264.7细                   测定试剂盒进行蛋白浓度测定，以磷酸盐缓冲液（PBS，
        胞以4×10 个/mL接种于96孔板中，每孔100 μL。将细胞                   pH 7.4）稀释至相应浓度。取上述蛋白，加入 5×Loading
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        随机分为对照组（0.5％DMSO）、LPS 模型组（1 μg/mL）、                Buffer上样缓冲液适量，煮沸变性；取变性蛋白样品50 μg，
        DEX 处理组（阳性对照，0.2 μg/mL DEX+1 μg/mL LPS，            于80 V条件下行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶
        DEX 剂量设置参考前期预试验结果，下同）和 GOEE 处                      电泳，电泳后于 100 mA 下湿法转膜，用 5％脱脂奶粉室
        理组（50、100、150、200、300 μg/mL GOEE+1 μg/mL LPS，      温封闭1 h，然后分别加入p-p65抗体（1 ∶ 500）、p-IκBα抗
        GOEE 剂量参考“2.4”项下结果），每组设 4 个复孔。按                    体（1 ∶ 500）、p65 抗体（1 ∶ 1 000）、IκBα抗体（1 ∶ 1 000）、
       “2.4”项下方法培养 24 h 后，收集各孔细胞培养液，以                      NRF2抗体（1 ∶ 500）、HO-1抗体（1 ∶ 1 000）、Lamin B抗体
        1 000 r/min 离心 5 min，取上清液，采用连续光谱扫描式                （1 ∶ 1 000）、GAPDH 抗体（1 ∶ 3 000），4 ℃孵育过夜；用
        酶标仪于 550 nm 波长处检测细胞培养液中 NO 的含                      TBST 溶液清洗 10 min×3 次，加入相应二抗（除 GAPDH
        量。严格按照试剂盒说明书操作，上述试验重复3次。                           为小鼠源二抗外，其余均为兔源二抗，稀释度均为


        中国药房    2020年第31卷第14期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 14  ·1721  ·
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