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干物固体粉末 0.6 g（转移率约为 60％）。称取该挥干物                     28～30 min，95％B→5％B；30～32 min，5％B）；柱温：
        粉末适量，用生理盐水制备成质量浓度为0.05 g/mL（以                      40 ℃；流速：0.25 mL/min；进样量：1 µL。
        挥干物质量计）的红禾麻提取物药液，备用。                               2.3.2  质谱条件      离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方
                                                                             －
        2.2.2  对照品溶液制备         分别精密称取 5-O-咖啡酰基             式：负离子模式（ESI ）；扫描范围：m/z 50～1 000；扫描
        奎宁酸、3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、芦                      方式：MS Continuum 模式；毛细管电压：4.5 kV；离子源
        丁、异槲皮苷、木犀草苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷                       温度：120 ℃；雾化气（N2 ）压力：1.2 bar；去溶剂气温度：
        对照品适量至量瓶中，加甲醇适量，超声溶解后并以甲                           300 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h；碰
        醇定容，混匀，制成各单一对照品贮备液，于－20 ℃避光                        撞能：15～32 V。采用外标亮氨酸脑啡肽（m/z 554.262 0
                                                                              TM
                                                                  －
        保存。临用前，分别取各贮备液适量，以甲醇适当稀释                           [M－H] ，Lock Spray 模式）进行实时采集校正；采用
        后即得。                                               MassLynx V4.1工作站进行质谱数据采集及处理。
        2.2.3  厌氧培养液制备         取厌氧培养液粉末 9 g，加至             2.3.3  代谢反应样品的预处理及测定                取“2.2.5”项下
        水 1 L 中，超声溶解后，在 121 ℃下高压蒸汽灭菌 20                    各组反应样品，室温解冻后同组混匀，取一半混合液分
        min，备用。                                            别转移至50 mL离心管中，加入等体积乙酸乙酯，涡旋3
        2.2.4  人肠道菌液制备        取人体粪便样本适量，加入 4               min 后再超声 8 min 进行萃取，然后以 8 000 r/min 离心 5
        倍量生理盐水，混匀，涡旋混合 3 min，以 6 000 r/min                 min，取上清液；下层再按同样的步骤提取 1 次，离心后
        离心5 min，取上清液，即得。                                   取上清液；再向下层中加入等体积水饱和正丁醇，同法
        2.2.5  分组代谢反应       取“2.2.4”项下人肠道菌液1 mL，           萃取，共萃取 2 次；合并 4 次萃取液，于 37 ℃下以 N2吹
        加至“2.2.3”项下厌氧培养液 9 mL 中，混匀后迅速置于                    干。残渣加入 50％甲醇 500 µL，涡旋混匀，超声使其溶
        厌氧培养罐中，加入1个厌氧产气袋后盖上培养罐盖，置                          解，以 13 000 r/min 离心 10 min，取上清液，按“2.3.1”
        于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，使人肠道菌液中的细菌                      “2.3.2”项下色谱和质谱条件进样分析。
        充分生长。试验分为给药组、空白对照A组、空白对照B                          2.4  红禾麻提取物在离体人肠道菌群中的代谢产物鉴
        组。给药组：将厌氧培养24 h后的人肠道菌液10 mL与                       定分析
        红禾麻提取物溶液 1 mL 混合均匀，立即置于厌氧培养                            经 UPLC-Q-TOF-MS 技术测得的红禾麻提取物在
        罐中，加入 1 个厌氧产气袋后迅速盖上培养罐盖，置于                         离体人肠道菌群中代谢产物的基峰图见图 1A～1C，采
        37 ℃恒温培养箱中培养 36 h；空白对照 A 组：将厌氧培                    用MassLynx V4.1工作站软件获得准分子离子高分辨质
        养24 h后的人肠道菌液10 mL（不加红禾麻提取物），按                      量数及其碎片离子信息；采用 MassLynx V4.1 软件中的
        给药组“立即置于厌氧培养罐……培养 36 h”步骤同法                       “Strip”模块进行差异图谱分析，得基峰图，见图 1D。根
        操作；空白对照 B 组：将厌氧培养液 10 mL 和红禾麻提                     据得到的质谱数据结合 UNIFI 软件进行代谢产物预测、
        取物溶液 1 mL 混合，按给药组“立即置于厌氧培养罐                        筛查  [15-16] ，再通过与已知对照品比对保留时间、相对分子
        ……培养 36 h”步骤同法操作。各组均平行 3 份样品操                      量、碎片离子来确定原型成分；利用高分辨质谱数据及
        作。将培养完毕的培养液转移至 50 mL EP 管中，于                       其误差值、保留时间、原型成分的裂解规律及相关文
        －20 ℃条件下保存，备用。所用器具均经121 ℃高压蒸                       献 [8，17-19] 进行代谢物推测分析。结果，从红禾麻提取物的
        汽灭菌20 min。                                         反应液中鉴定出3个原型成分和22个代谢产物，其分析
        2.3  红禾麻提取物在离体人肠道菌群中代谢反应样品                         结果见表1，其代谢途径见图2。
        的测定                                                2.5 原型产物解析
            参照文献方法      [8，14] ，采用UPLC-Q-TOF/MS技术测定            M1、M2、M12：分别在保留时间 17.02、20.50、19.69
        分组代谢产物。                                            min 处，出现准分子离子 m/z 609.144 5[M－H] 、m/z
                                                                                                      －
                                                                           －
        2.3.1  色 谱 条 件    色 谱 柱 ：Agilent Eclipse Plus C18  447.092 9[M－H] 、m/z 593.153 5[M－H] ，通过 Mass-
                                                                                               －
        RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：0.01％甲酸水            Lynx V4.1工作站软件（下同）预测其分子式为C27H29O16、
        溶液（A）-0.01％甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～1.5                    C21H19O11、C27H29O15，与芦丁、槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖
        min，5％B；1.5～6 min，5％B→9％B；6～9 min，9％B；             苷对照品的相对分子量和保留时间均一致，由此确定
        9～11 min，9％B→12％B；11～13 min，12％B→15％B；             M1为芦丁、M2为槲皮苷、M12为山柰酚-3-O-芸香糖苷。
        13～25 min，15％ B→20％ B；25～26 min，20％ B→             2.6 代谢产物解析
        70％B；26～27 min，70％B→95％B；27～28 min，95％B；               M3：在保留时间 4.08 min 处，出现准分子离子 m/z


        中国药房    2020年第31卷第14期                                            China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 14  ·1685  ·
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