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究院细胞资源中心。                                          液 10 μL，混匀，室温避光孵育 10～20 min，然后采用流
        2 方法                                               式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡率。
        2.1 造模、分组与给药                                       2.5 各组大鼠肿瘤组织中Bax、Bcl-2水平检测
            参照文献方法      [6-7] ，将胃癌BGC823细胞加入含10％               采用 Western blotting 法检测。取“2.2”项下分离的
        胎牛血清的RPMI1640 培养基（以下简称“培养基”），置                     大鼠肿瘤组织（每组分别取5份）适量，放入玻璃匀浆器，
        于 37 ℃、5％ CO2恒温培养箱培养，定期更换新鲜培养                      加入RIPA蛋白裂解液裂解，于4 ℃条件下以12 000 r/min
        基，待细胞处于对数生长期时，收集细胞，调整成密度为                          离心10 min后，采用BCA法测定上清液中的蛋白浓度，
        5×10 个/mL的细胞悬液，备用。                                 并进行变性处理。取变性后的蛋白样品进行十二烷基
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            取75只大鼠分为对照组、模型组、顺铂组、白芍总苷                       硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）分离，转膜；加入
        组、白芍总苷+顺铂组，每组 15 只。除对照组大鼠于腹                        封闭液室温封闭 1 h 后，加入 Bax、Bcl-2、GAPDH 抗体
        部皮下注射生理盐水外，其余各组大鼠于腹部皮下注射                           （稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以 PBST 清洗 3
                                            60
        阿糖胞苷（200 mg/kg），48 h后对大鼠进行 Co全身照射                  次，加入二抗（稀释度为1∶2 000），室温孵育1 h，以PBST
       （剂量为 10 Gy/只），照射后第 2 天于大鼠内侧近腹股沟                     清洗3次，加入ECL显色液显影，利用凝胶成像仪成像、
        处皮下接种上述BGC823细胞悬液（0.8 mL/只），建立大                    Image J 1.4.8 软件进行灰度分析，以目的蛋白与内参蛋
        鼠胃癌模型     [6-7] 。每天观察记录大鼠的生理和精神情况，                 白条带的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
        若皮下出现米粒大小质硬结节则视为模型建立成功。                            2.6 各组大鼠尿液中IL-18、KIM-1水平检测
        造模成功后，顺铂组大鼠腹腔注射顺铂（25 mg/kg，剂量参                         取“2.2”项下收集的大鼠尿液（每组分别取 5 份）适
        考相关文献 设置），每7 d给药1次，共给药5次；白芍总                       量，采用IL-18、KIM-1检测试剂盒，按照说明书方法检测
                  [8]
        苷组大鼠灌胃白芍总苷（200 mg/kg，剂量参考相关文献                 [9]
                                                           尿液中IL-18、KIM-1水平。
        设置，临用时用水溶解），每天给药 1 次，连续给药 28 d；                    2.7  各组大鼠血清中BUN、Scr水平检测
        白芍总苷+顺铂组大鼠腹腔注射顺铂并灌胃白芍总苷，
                                                               取“2.2”项下分离的大鼠血清（每组分别取 5 份）适
        给药剂量和时间同单药组；对照组及模型组大鼠灌胃等                           量，利用全自动生化分析仪检测血清中BUN、Scr水平。
        量生理盐水，连续给药28 d。                                    2.8  各组大鼠肾组织中SOD、MDA、GSH水平检测
        2.2  取材
                                                               取“2.2”项下分离的大鼠肾组织（每组分别取 5 份）
            末次给药后，收集各组大鼠 24 h 尿液；尿液采集结
                                                           适量，用 4 ℃预冷的生理盐水洗去表面血液，滤纸吸干
        束后，对大鼠腹腔注射 10％水合氯醛进行麻醉，腹主动
                                                           表面水分，按照 ELISA 试剂盒说明书检测肾组织中
        脉取血至离心管中，于4 ℃静置4 h后，在4 ℃条件下以                       SOD、MDA、GSH水平。
        3 500 r/min 离心 10 min，取上层血清；血清采集结束后，
                                                           2.9  各组大鼠肾组织病理学观察
        将大鼠颈椎脱臼处死，在无菌条件下迅速分离肿瘤组织
                                                               取“2.2”项下分离的大鼠肾组织（每组分别取 5 份）
       （对照组大鼠未发现肿瘤）和肾组织。
        2.3  各组大鼠瘤质量及肿瘤抑制率测定                               适量，在 10％中性甲醛中固定 24 h 后，转移至 75％乙醇
                                                           中，经自动组织脱水机脱水、透明处理，在石蜡包埋机中
            取“2.2”项下分离的各组大鼠肿瘤组织适量，用4 ℃
        预冷的生理盐水洗去肿瘤组织表面血液，再用滤纸吸干                           浸蜡、包埋、切片（5 μm）、水浴展开、捞片、沥干，于恒温
                                                           箱中烘干 2 h 后，进行常规苏木精-伊红（HE）染色，并于
        表面水分，称质量，并计算肿瘤抑制率[肿瘤抑制率
                                                           显微镜下进行肾组织病理学观察。
       （％）＝（模型组大鼠瘤质量－给药组大鼠瘤质量）/模型
                                                           2.10  统计学方法
        组大鼠瘤质量×100％]。
                                                               采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行分析。计量
        2.4 各组大鼠肿瘤组织的细胞凋亡率检测
            采用流式细胞术检测。取“2.2”项下分离的大鼠肿                       资料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜
        瘤组织（每组分别取5份）适量，在无菌条件下用D-Hank’s                     0.05表示差异有统计学意义。
        液冲洗3次后，制成约1 mm 的小块，用吸管吸取数小块                        3 结果
                               3
        肿瘤组织，均匀排列在培养皿上，置于 37 ℃、5％CO2培                      3.1 各组大鼠的瘤质量及肿瘤抑制率测定结果
        养箱中培养 7ｈ，使其贴壁；取出培养皿后，加入培养基                             与模型组比较，顺铂组、白芍总苷组、白芍总苷+顺
        4 mL，再按上述条件继续培养；每隔 24 h 更换 1 次培养                   铂组大鼠瘤质量均显著降低（P＜0.05）；与顺铂组比较，
        基，待细胞长出后，弃去组织块，继续培养至细胞融合度                          白芍总苷+顺铂组大鼠瘤质量均显著降低，肿瘤抑制率
        达90％；用胰蛋白酶消化细胞，进行3次传代培养 。取                         显著升高（P＜0.05）；与白芍总苷组比较，白芍总苷+顺
                                                  [10]
        传代培养后的细胞，用胰蛋白酶消化，以 1 000 r/min 离                   铂组大鼠瘤质量显著降低，肿瘤抑制率显著升高（P＜
        心5 min，弃上清，加入适量培养基重悬细胞后，以2 000                     0.05）。这提示白芍总苷联合顺铂能抑制胃癌模型大鼠
        r/min 离心 5 min，弃上清液，然后加入 Annexin Ⅴ-FITC            肿瘤的增长，且抑制作用显著优于单用顺铂或白芍总
        结合液 200 μL 混匀，室温避光孵育 15 min，再加入 PI 染               苷。各组大鼠的瘤质量及肿瘤抑制率测定结果见表1。


        中国药房    2020年第31卷第13期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 13  ·1597  ·
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