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本 Olympus 公司）；TI-U-DS-RI2 型倒置荧光显微镜（日               学教研室馈赠。
        本Nikon公司）；Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（德               2 方法
        国 Eppendorf 公司）；TS-8 型转移脱色摇床、VORTEX-5              2.1 细胞培养
        型涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；                               将人乳腺上皮细胞MCF-10A培养于DMEM/F12全
        Step One Plus 型实时荧光定量-聚合酶链式反应（PCR）                 培养基中（含有 10％马血清、10 ng/mL 霍乱毒素、50
                   TM
        仪（美国Applied Biosystems公司）。                         ng/mL 氢化可的松、10 μg/mL 胰岛素、20 ng/mL EGF 以
        1.2 药品与试剂                                          及1％青链霉素，下同），在37 ℃、5％CO2的培养箱（后文
            E2标准品（批号：WXBC5362V，纯度：＞98％）、Cal-               条件相同）中进行培养，每48 h更换1次培养液。
        peptin（批号：C8999，纯度：＞98％）、氢化可的松标准品                  2.2 细胞转化试验
       （批号：PHR1014，纯度：100％）、霍乱毒素（批号：C8052，                     将乳腺上皮细胞 MCF-10A 随机分为对照组、E2转
        纯度：95％）均购自美国 Sigma 公司；U0126（ERK 抑制                 化组（DMSO 终体积分数为 0.1％，下同）和 E2转化+Cal-
        剂，美国 Med Chem Express 公司，批号：HY-12031，纯
                                                           peptin 组（DMSO 终体积分数为 0.1％，下同）。3 组细胞
        度：＞98％）；马血清、0.25％胰蛋白酶、B-27 添加物
                                                           分别以0.1％DMSO、E2 （50 nmol/L）、E2 （50 nmol/L）+Cal-
       （50×）（美国Gibco公司，批号分别为：1893656、2046777、
                                                           peptin（1 μmol/L）连续处理 15 代，每次传代时均加入相
        2046964）；表皮生长因子（EGF，美国PeproTech公司，批
                                                           应药物处理，然后按照“2.1”项下条件进行培养，观察细
        号：0515AFC05）；成纤维细胞生长因子（FGFB，中国近
                                                           胞形态变化并拍照。细胞转化标志：细胞形态发生变化
        岸蛋白质科技有限公司，批号：0331504）；重组人胰岛素
                                                           （细胞胞体变大，胞内出现黑色颗粒，排列紊乱，呈长梭
       （上海翊圣生物科技有限公司，批号：11820131，含量：
                                                           形贴壁生长，具有一定的间质细胞样特性），生长加速，
        95％～105％）；磷酸盐缓冲液（PBS）粉末、1％结晶紫染
                                                           克隆形成能力增强 。
                                                                           [5]
        色液、5×蛋白质上样缓冲液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰
                                                           2.3  MTT试验检测细胞的增殖能力
        胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒、高效RIPA组织/快
                                                               取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别用0.25％胰
        速裂解液、膜再生液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别
                                                           蛋白酶消化后，以1 000 r/min离心5 min，用DMEM/F12
        为：1022Q021、20180627、20190328、20191104、20190711、
                                                                                                4
                                                           全培养基重悬并调整各组细胞密度至4×10 个/mL，然后
        20190715）；青链霉素、DMEM/F12 培养基（美国 Hy-
                                                           接种于 96 孔板中，每孔 200 μL，每组设置 5 个复孔。另
        clone 公司，批号分别为：J150038、AE28870264）；二喹啉
                                                           外设置不加细胞只加培养基的调零孔。将培养板置于
        甲酸（BCA）蛋白浓度试剂盒（美国 Thermo Fisher Scien-
                                                           培养箱中培养至细胞贴壁，吸弃培养液，每孔中加入
        tific 公司，批号：UD277257）；MTT 试剂盒（北京博奥拓
                                                           200 μL 不含血清的 DMEM/F12 培养基，继续培养 24、48
        科技有限公司，批号：298-93-1）；Trizol试剂（美国Ambi-
                                                           h后，每孔中均避光加入5％MTT试液20 μL，混匀，培养
        on Life Technologies公司，批号：149002）；反转录试剂盒
        PrimeScript TM  RT reagent Kit、PCR 反应试剂 SYBR Pre-  3 h后，终止培养；弃去培养基，加入150 μL DMSO溶液，
                                                   ®
                                                           低速振荡 10 min。使用酶标仪于 490 nm 波长下测定各
                 TM
        mix Ex Taq Ⅱ（日本Takara公司，批号分别为：AK6301、
        AIG2363A）；CD44小鼠单克隆抗体、ERK兔多克隆抗体                    孔吸光度（OD），计算细胞增殖率。细胞增殖率（％）＝
       （美国Cell Signaling Technolog公司，批号分别为：3570S、          （给药组 OD 值－调零孔 OD 值）/（对照组 OD 值－调零
        4695S）；Nanog、OCT4兔单克隆抗体（美国Abcam公司，                 孔OD值）×100％。试验重复3次。
        批号分别为：ab109250、ab109183）；磷酸化ERK（p-ERK）             2.4 平板克隆试验检测细胞的克隆形成能力
        小鼠多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：SC-7383）；                    取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别按400个/孔
        α-微管蛋白（α-tubulin）兔多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱                  接种于 6 孔板中，每组设置 3 个复孔。每孔中加入 4 mL
        氢酶（GAPDH）鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的                         DMEM/F12 全培养基，于培养箱中培养 14 d；弃去培养
        山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗、辣根过氧化物酶标                        液，以 PBS 洗涤 3 次，加入 4％多聚甲醛溶液固定 30
        记的山羊抗鼠 IgG 二抗（美国 Bioworld 公司，批号分别                  min；以0.1％结晶紫染色30 min后，洗去染色液，常温晾
        为：BS1699、MB001、BS13278、BS12478）；甲醇、二甲基             干。用相机拍照并观察其克隆集落形成情况，使用 Im-
        亚砜（DMSO）、乙醇等均为分析纯，水为双蒸水。CD44、                      age J 1.8.0 软件对克隆集落进行计数，并计算其克隆形
        Nanog、OCT4、ERK 和 GAPDH 引物均由生工生物工程                  成率。克隆形成率（％）＝（克隆集落形成数/接种细胞总
       （上海）股份有限公司合成。                                       数）×100％。试验重复3次。
        1.3  细胞                                            2.5 悬浮成球试验检测细胞的自我更新能力
            人乳腺上皮细胞MCF-10A由陆军军医大学生物化                           取“2.2”项下 3 组处于对数生长期细胞，分别按


        中国药房    2020年第31卷第13期                                             China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 13  ·1551  ·
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